劉 蘇，張勝利

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥 230036;2.亳州師范高等?？茖W(xué)校 理化系，安徽 亳州 236800）

自然界中幾乎所有的生物都表現(xiàn)出以24 h為周期的晝夜節(jié)律現(xiàn)象。生物節(jié)律受到一系列生物鐘基因的調(diào)控，包括 period，timeless，clock，cycle以及“cryptochrome等［1-2］。隱花色素基因（cryptochrome，簡(jiǎn)稱cry）編碼的CRY蛋白是一類藍(lán)光受體，參與生物體內(nèi)的光介導(dǎo)過程以及生物鐘的形成［3］。CRY的氨基酸序列與DNA光解酶具有較高的相似性，但CRY并無(wú)DNA光解酶對(duì)DNA嘧啶二聚體的修復(fù)活性［3］。CRY普遍存在于動(dòng)植物及微生物中，但其所行使的功能并不相同:植物CRY是一種對(duì)光敏感的藍(lán)光受體;哺乳動(dòng)物（如小鼠）有2個(gè)CRY，但它們對(duì)光線并不敏感，而具有轉(zhuǎn)錄抑制活性;昆蟲體內(nèi)同時(shí)具有光受體型CRY（CRY1）和轉(zhuǎn)錄抑制型CRY（CRY2）［2-3］。此外，人們發(fā)現(xiàn)昆蟲存在3種不同的生物鐘調(diào)控機(jī)制:只含有CRY1的調(diào)控機(jī)制（以果蠅Drosophila melanogaster為代表）、只含有CRY2（以蜜蜂Apis mellifera為代表）的調(diào)控機(jī)制以及CRY1和CRY2共同參與的調(diào)控機(jī)制（以帝王斑蝶Danaus plexippus為代表）［4］。

由于節(jié)律行為會(huì)影響昆蟲的各種生理過程，例如交配、產(chǎn)卵、滯育以及對(duì)殺蟲劑的忍耐力等，因此cry基因引起了研究者的極大興趣。當(dāng)前，一些模式昆蟲的cry基因已被克隆，并且其功能也已被深入研究［4-6］。此外，通過體外蛋白表達(dá)以及RNA干擾等手段，人們對(duì)一些非模式昆蟲的CRY的功能也進(jìn)行了研究。例如，沉默豆緣蝽（Riptortus pedestris）的cry2v基因之后，試蟲表現(xiàn)出紊亂的節(jié)律行為，同時(shí)體壁的周期性合成也受到干擾［7］。又如，?；页嵋苟辏⊿podoptera littoralis）的cry1和cry2在觸角嗅覺感器之中大量表達(dá)，暗示它們與昆蟲嗅覺的周期性波動(dòng)相關(guān)［8］。

二化螟（Chilo suppressalis）屬鱗翅目螟蛾科（Lepidoptera:Pyralidae），是水稻的重要害蟲之一［9］。此蟲多在夜間活動(dòng)，且對(duì)光線具有一定的敏感性，因此，推測(cè)其cry基因可能與其晝夜節(jié)律有關(guān)。本研究克隆了2個(gè)二化螟隱花色素基因（命名為Cs-cry1和Cs-cry2），并對(duì)其分子特性進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步了解二化螟生物鐘的調(diào)控機(jī)制，為二化螟的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試二化螟幼蟲采集自合肥市郊區(qū)水稻田。幼蟲在實(shí)驗(yàn)室中用TN1水稻苗飼養(yǎng)備用。飼養(yǎng)條件為:溫度26±1℃，相對(duì)濕度75%，光照:黑暗=16∶8h。幼蟲化蛹后，轉(zhuǎn)移至聚丙烯塑料飯盒（15×15×10cm）內(nèi)待其羽化。羽化的成蟲以15%蜂蜜水飼喂。

1.2 分子克隆

取二化螟1～3日齡成蟲，置于冰上解剖觸角、頭部、胸、腹、足和翅等不同組織，并將各組織分別置液氮中研磨成粉末后，用RNAiso Plus試劑（寶生物公司，大連）提取總RNA。取2 μg頭部組織的總RNA，用PrimeScript 1st-strand反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物公司，大連）合成第一鏈cDNA。根據(jù)Genbank上登錄的鱗翅目cry1和cry2分別設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（cry1-F:5’-TGCTTYGAGCARGAYTGYGAGC-3’，cry1-R:5’-ACCCACATCCAGTTRCCRGCGCA-3’;cry2-F:5’-GARTGGGGWACHACRGCGTTRAC-3’，cry2-R:5’-CCAYGGYTCRTGKATRTACCGCGT-3’），用于擴(kuò)增二化螟Cs-cry1和Cs-cry2的部分保守序列。隨后，根據(jù)得到的保守序列再設(shè)計(jì)基因特異性引物，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得基因的5’和3’區(qū)域。所用引物為 cry1-5race:5’-GTGGAAGACAGTCGACCTTGGTGT-3’，cry1-3race:5’-CTCAACGTGGAGTACGAGACATTC-3’;cry2-5race:5’-CTCGTCGATAAACATCCAAACCTC-3’，cry2-3race:5’-CACCACTCCAATAGCTGACGATC-3’。RACE使用寶生物公司的5’-RACE和3’-RACE試劑盒進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增均使用Tks Gflex DNA聚合酶（寶生物公司，大連）進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切下目的條帶回收純化后，送上海Invitrogen生物公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

簡(jiǎn)并引物PCR以及RACE擴(kuò)增所獲得的序列使用DNAman軟件進(jìn)行拼接;序列一致性分析以及同源基因的搜索使用 NCBI的BLAST 程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）;蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)和分子量的計(jì)算使用ExPASy的ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam）;蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與關(guān)鍵催化氨基酸的確定使用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）;二化螟Cs-cry1和Cs-cry2編碼的蛋白連同其它昆蟲的CRY一并提交至Clustal Omega服務(wù)器（http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo）進(jìn)行多序列連配，連配結(jié)果導(dǎo)入MEGA5.05軟件（http://www.megasoftware.net），以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，分支置信度經(jīng)1000次自舉重復(fù)測(cè)驗(yàn)。

1.4 組織表達(dá)譜分析

使用半定量RT-PCR分析二化螟Cs-cry1和Cs-cry2基因在不同組織內(nèi)的表達(dá)譜。取2 μg來(lái)源于二化螟觸角、頭部、胸、腹、足和翅等不同組織的RNA，使用PrimeScript 1st-strand反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，并將所有cDNA樣品用去離子水稀釋至100 ng/μL。RT-PCR引物為:cry1-F:5’-CTGGAT-GTGGGTATCTTCAT-3’，cry1-R:5’-CATTTCAATCATGTCATGACT-3’;cry2-F:5’-GTTACAAAGACCGAATGTCAT-3’，cry2-R:5’-GTCTCGATGTGTGAATGTTCAT-3’，使用二化螟的18S rRNA基因作為內(nèi)參基因（引物為18S-F:5’-TCGAGCCGCACGAGATTGAGCA-3’，18S-R:5’-CAAAGGGCAGGGACGTAATCAAC-3’）。RT-PCR使用Tks Gflex DNA聚合酶，反應(yīng)體系為25 μL（含2× buffer 12.5 μL，酶 0.5 μL，上下游引物各 0.25 μM，cDNA 模板 1 μL）。PCR 儀器為 ABI公司 GeneAmp 9700 型，熱循環(huán)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性1 min;98°C 變性10 s，55°C 退火15 s，68°C 延伸30 s，30 個(gè)循環(huán);68°C后延伸5 min。RT-PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，溴化乙錠染色，并在紫外光下拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的獲得

使用簡(jiǎn)并引物PCR并結(jié)合RACE技術(shù)成功克隆了二化螟的Cs-cry1和Cs-cry2基因全長(zhǎng)序列。序列已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為HG780135和KF977409。Cs-cry1序列中含有1605 bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)由534個(gè)氨基酸組成的Cs-CRY1蛋白。該蛋白理論分子量為61.44 kDa，等電點(diǎn)為6.24。Cs-cry2的開放閱讀框?yàn)?289 bp，編碼的Cs-CRY2蛋白含有762個(gè)氨基酸，理論分子量與等電點(diǎn)分別為87.28 kDa和8.60。Cs-CRY1的氨基酸序列與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera，一致性88%）、柞蠶（Antheraea pernyi，87%）、家蠶（Bombyx mori，86%）以及帝王斑蝶（D.plexippus，83%） 的CRY1具有很高的一致性;而Cs-CRY2則與棉鈴蟲（79%）、帝王斑蝶（78%）、家蠶（74%）以及柞蠶（72%）的CRY2較為一致。然而Cs-CRY1與Cs-CRY2之間的一致性卻較低，只有42%。在Cs-CRY1和Cs-CRY2的氨基酸序列中均沒有預(yù)測(cè)出信號(hào)肽剪切位點(diǎn)和跨膜區(qū)。通過比對(duì)NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在Cs-CRY1和Cs-CRY2中均有保守的DNA光解酶結(jié)構(gòu)域和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合區(qū)域（圖 1）［10］。

圖1 二化螟Cs-CRY1、Cs-CRY2與其它物種CRY序列連配Fig.1 Alignment of the Chilo suppressalis CRY1，CRY2 with their respective orthologs from other insect species

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了深入了解昆蟲CRY的親緣關(guān)系，選擇了來(lái)自不同昆蟲的CRY氨基酸序列，使用鄰接法構(gòu)建了進(jìn)化樹（圖2）。從圖中可見，CRY1與CRY2被劃分為2個(gè)截然不同的亞家族，而在各個(gè)亞家族中，來(lái)自同一目昆蟲的CRY均聚在同一分支之上。二化螟CRY1和CRY2與鱗翅目昆蟲的CRY聚為一支，表示它們?cè)谶M(jìn)化中有著更緊密的親緣關(guān)系。CRY的親緣關(guān)系與昆蟲進(jìn)化關(guān)系表現(xiàn)出高度一致性。

圖2 昆蟲CRY的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Chilo suppressalis CRY1 and CRY2 with other insect CRYs

2.3 組織表達(dá)譜分析

檢測(cè)了Cs-cry1與Cs-cry2基因在二化螟成蟲不同組織中的表達(dá)譜（圖3），結(jié)果表明:Cs-cry1與Cs-cry2基因在各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量不同。其中Cs-cry1在觸角、頭部、腹部和足中表達(dá)量較高，胸和翅中較低;Cs-cry2基因在腹部表達(dá)量最高，頭部和胸部次之，觸角、翅和足較低。

圖3 二化螟成蟲不同組織中Cs-cry1和Cs-cry2的表達(dá)譜Fig.3 Expression profiles of Cs-cry1 and Cs-cry2 in different tissues of Chilo suppressalis adults.

3 討論與結(jié)論

隱花色素基因cry是昆蟲生物鐘系統(tǒng)的核心基因之一，在介導(dǎo)昆蟲晝夜節(jié)律、調(diào)控昆蟲多種行為過程中起著重要作用［1-3］。目前，對(duì)于模式生物cry基因的作用機(jī)制已有較為深入的研究［4，6，12］，而對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲，相關(guān)的研究較為有限。水稻害蟲二化螟的生物鐘基因尚未見報(bào)道。本研究克隆獲得了二化螟的2個(gè)隱花色素基因Cs-cry1和Cs-cry2，為后續(xù)的基因功能研究奠定了前期基礎(chǔ)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明昆蟲的cry分化為cry1和cry2兩個(gè)亞家族，這與前人研究結(jié)果一致［4，11，13］。Yuan等［4］分析了昆蟲cry基因的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化中cry基因至少發(fā)生了兩輪基因丟失事件，導(dǎo)致昆蟲出現(xiàn)了3種不同的cry表達(dá)模式:僅有cry1（如果蠅）、僅有cry2（如蜜蜂）及同時(shí)具有cry1和cry2（如帝王斑蝶）。不同的cry基因存在模式意味著不同的生物鐘調(diào)控機(jī)制，例如帝王斑蝶的cry1基因編碼的CRY1蛋白是光受體，而cry2基因編碼的CRY2蛋白卻是負(fù)反饋回路中的轉(zhuǎn)錄抑制因子，這套生物鐘機(jī)制與果蠅和蜜蜂等完全不同［4，6，12］。本研究發(fā)現(xiàn)二化螟同時(shí)存在2個(gè)cry基因，暗示著二化螟可能具有與帝王斑蝶類似的節(jié)律調(diào)控機(jī)制。

Cs-cry1和Cs-cry2在二化螟成蟲各組織中均有表達(dá)，這暗示著生物鐘不僅存在于二化螟的腦部，還同時(shí)存在于其它外周器官之中。Yan等［13］發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲cry1和cry2基因在成蟲各組織中均可檢測(cè)到，其中cry1在腹部的表達(dá)量最高而觸角中表達(dá)量最低;cry2在胸部的表達(dá)量最高而頭部最低。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能是物種差別所致。此外，Cs-cry1和Cs-cry2在二化螟觸角中均有一定量的表達(dá)。Merlin等發(fā)現(xiàn)?；页嵋苟甑腸ry基因表達(dá)于觸角的嗅覺感器內(nèi)，并且在24 h周期內(nèi)，cry基因表達(dá)水平的波動(dòng)與試蟲觸角電位反應(yīng)的變化有聯(lián)系，暗示著cry可能參與了嗅覺節(jié)律的調(diào)控［8，14］。但是cry對(duì)二化螟生物鐘具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚，有待今后繼續(xù)研究。

綜上所述，本研究利用簡(jiǎn)并引物PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆了二化螟隱花色素基因Cs-cry1和Cs-cry2全長(zhǎng)序列，分析了這2個(gè)基因與其它鱗翅目cry基因的進(jìn)化關(guān)系，并研究了這2個(gè)基因在二化螟成蟲不同組織內(nèi)的表達(dá)模式，以期為揭示cry在二化螟生物鐘分子機(jī)制中的作用，以及為利用生物鐘調(diào)節(jié)害蟲的節(jié)律進(jìn)而防治害蟲提供一定的理論依據(jù)。

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