孫賽君，袁卉，蔣金鵬，陶露，錢鋒

（長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州434023）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是因嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致高尿酸血癥、尿酸鹽在關(guān)節(jié)周圍沉積而引起的炎癥反應(yīng)，臨床表現(xiàn)主要為紅腫熱痛［1－2］。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療藥物的研究以降低血尿酸水平、消炎、消腫和鎮(zhèn)痛為主［3－5］。而研究所用動(dòng)物模型仍以Coderre在1987年建立的關(guān)節(jié)腔注射微晶尿酸鈉（MSU）大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型為主［6］。但是該模型并未涉及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病基礎(chǔ)——高尿酸血癥，在評(píng)價(jià)抗痛風(fēng)藥物的作用機(jī)制上有明顯缺陷。相對(duì)而言，高尿酸血癥的動(dòng)物模型比較容易建立。目前有高嘌呤膳食、尿酸酶抑制劑和破壞尿酸酶表達(dá)基因等方法［7－9］。然而因多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)都存在人體內(nèi)沒有的尿酸酶，所以將高尿酸血癥模型轉(zhuǎn)化為痛風(fēng)模型極為困難［10］。國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了聯(lián)合使用Coderre法和尿酸酶抑制劑或次黃嘌呤建立高尿酸痛風(fēng)大鼠模型的嘗試［10］，但該方法只是分別誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和高尿酸血癥，因此未被廣泛采用。現(xiàn)存急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型都有很多不完善之處，給痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究帶來了極大的不便，因此建立高尿酸血癥誘發(fā)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型迫在眉睫。

從人類痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病情況來看，高尿酸血癥是其發(fā)病基礎(chǔ)，而寒冷的外部環(huán)境是其重要誘發(fā)因素之一。本實(shí)驗(yàn)將以次黃嘌呤灌胃這種簡(jiǎn)單的方法誘導(dǎo)大鼠短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)高嘌呤血癥，同時(shí)對(duì)大鼠右下肢膝關(guān)節(jié)部位進(jìn)行冰敷，觀察是否可誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。如果誘發(fā)成功，則為該疾病的基礎(chǔ)和臨床研究建立了更為適用的動(dòng)物模型。另外，因次黃嘌呤灌胃和冰敷對(duì)大鼠創(chuàng)傷較小，可重復(fù)多次進(jìn)行，所以本實(shí)驗(yàn)還將嘗試通過重復(fù)誘導(dǎo)同一關(guān)節(jié)的痛風(fēng)來觀察是否可以建立慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008－0004。次黃嘌呤（Sig ma產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 次黃嘌呤溶液配置 次黃嘌呤5g溶于100 ml蒸餾水中，配成5%溶液，灌胃劑量按10 ml／kg體質(zhì)量來計(jì)算。

1.2.2 動(dòng)物分組 健康雄性SD大鼠25只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：正常組7只；冰敷組6只；次黃嘌呤灌胃組6只；次黃嘌呤灌胃加冰敷組6只。

1.2.3 冰敷方法 小氣球灌水冷凍1～2h，形成冰水混合物。將需要冰敷的SD大鼠以仰臥位包裹固定于木板上，保持右下肢伸直微曲。將含冰水混合物的小氣球用紗布包裹放置于右下肢膝關(guān)節(jié)正上方，接觸面覆蓋膝關(guān)節(jié)正面和左右兩側(cè)。每半小時(shí)更換一次，保持低溫。每天持續(xù)冰敷3h。次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠在灌胃完成半小時(shí)后開始冰敷，其它同冰敷組。

1.2.4 結(jié)果判定 ①關(guān)節(jié)腫脹程度：冰敷完成1h后，關(guān)節(jié)屈位，測(cè)量橫向最大徑。每只大鼠取右下肢最大徑減左下肢最大徑差值，組內(nèi)求平均值，然后進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。②步態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：冰敷完成2h后，觀察大鼠步態(tài)，正常行走記0分；輕微跛行，即右下肢略有彎曲，記1分；跛行，即右下肢可觸及地面但明顯彎曲，記2分；重度跛行，即右下肢不觸及地面，僅三足行走，記3分。組內(nèi)求平均值，然后進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹程度比較

實(shí)驗(yàn)過程持續(xù)10d，次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠從第3天開始出現(xiàn)顯著的關(guān)節(jié)腫脹及其它身體不適反應(yīng)，第7天開始出現(xiàn)食欲不振和腹瀉，實(shí)驗(yàn)第10天出現(xiàn)死亡，6只大鼠中死亡2只，于是決定停止實(shí)驗(yàn)。與正常組大鼠比較，冰敷組和次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），尤以第3～7天次黃嘌呤灌胃加冰敷組的改變最為明顯。第2～7天，次黃嘌呤灌胃加冰敷組對(duì)比冰敷組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。圖1中顯示了第1～10天各組大鼠左右膝關(guān)節(jié)橫向最大徑差值的組內(nèi)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

圖1 不同時(shí)相各組大鼠左右膝關(guān)節(jié)橫向最大徑差值比較

2.2 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較

正常組、次黃嘌呤灌胃組和冰敷組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間步態(tài)均無異常，僅次黃嘌呤加冰敷組大鼠在實(shí)驗(yàn)第3～6天出現(xiàn)輕度跛行，第1～6天步態(tài)評(píng)分分別為：0、（0.5±0.55）、（1.5±0.55）、（1.8±0.4）、（1.8±0.4）、（1.7±0.52）分。第7天開始，該組大鼠在冰敷后出現(xiàn)明顯身體不良反應(yīng)，如食欲不振、腹瀉、毛發(fā)豎立、活動(dòng)減少等。冰敷后數(shù)小時(shí)內(nèi)，該組大鼠多俯臥不動(dòng)，刺激無效，故難以判斷步態(tài)，而且從偶爾站立情況來看，左右下肢并無顯著差異。因此，從第7～10天，次黃嘌呤加冰敷組大鼠步態(tài)評(píng)分都記為零。

2.3 大鼠關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)檢查

為了觀測(cè)重復(fù)次黃嘌呤灌胃加冰敷對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)是否可造成長(zhǎng)期影響，在停止灌胃和冰敷3d后，再次檢測(cè)該組大鼠右下肢膝關(guān)節(jié)腫脹程度和步態(tài)，并以戊巴比妥鈉麻醉后暴露右下肢膝關(guān)節(jié)進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹消失，步態(tài)正常，鏡下形態(tài)學(xué)特征與正常關(guān)節(jié)無差異。

3 討論

人類易發(fā)痛風(fēng)是因長(zhǎng)期高嘌呤飲食和體內(nèi)缺乏尿酸酶等因素導(dǎo)致的嘌呤代謝紊亂、高尿酸血癥，最終尿酸鹽因飽和在組織內(nèi)沉積而引起［1］。哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)都含有尿酸酶，可迅速將體內(nèi)過多的尿酸代謝為水溶性良好并無毒的尿囊素隨尿液排出體外，因此通過高尿酸血癥誘發(fā)痛風(fēng)動(dòng)物模型極為困難［11］。考慮到低溫環(huán)境對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)作用，而國(guó)內(nèi)亦有通過單純低溫處理小鼠膝關(guān)節(jié)制備骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的先例［12］，筆者設(shè)計(jì)以次黃嘌呤灌胃法建立的高尿酸血癥大鼠模型為基礎(chǔ)，并在灌胃后立即對(duì)大鼠右下肢膝關(guān)節(jié)持續(xù)冰敷3h以促發(fā)尿酸鹽在低溫局部析出結(jié)晶，從而建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。次黃嘌呤灌胃法建立的高尿酸血癥大鼠模型可致血尿酸水平短時(shí)間內(nèi)達(dá)到500μmol／L左右［9］，而尿酸鹽在30oC時(shí)的最大溶解度不足300μmol／L［13］，若不考慮大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織液與血液間尿酸鹽濃度的差異，則以局部冰敷促使膝關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生尿酸鹽結(jié)晶在理論上是可行的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單純次黃嘌呤灌胃組大鼠對(duì)比正常對(duì)照組未出現(xiàn)腫脹和步態(tài)異常。而冰敷組大鼠膝關(guān)節(jié)在每次冰敷后都有一定程度腫脹，雖然與正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但腫脹程度并不明顯，可能與低溫導(dǎo)致的關(guān)節(jié)水腫和炎癥反應(yīng)有關(guān)［12］。冰敷組大鼠并未表現(xiàn)顯著的步態(tài)異常。雖然文獻(xiàn)有通過持續(xù)低溫刺激膝關(guān)節(jié)30d建立骨性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的報(bào)道，但在本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作中卻發(fā)現(xiàn)諸多不便。其一，未經(jīng)過麻醉將動(dòng)物固定并暴露單側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間冰敷實(shí)際對(duì)動(dòng)物是一種制動(dòng)，對(duì)后期行為學(xué)評(píng)價(jià)有影響；其二，操作有困難，大鼠膝關(guān)節(jié)部位較小，冰敷范圍難以控制；其三，冰敷組大鼠在重復(fù)多天冰敷后出現(xiàn)明顯身體不適，如活動(dòng)力下降、腹瀉和食欲減退等，說明該操作不可長(zhǎng)期持續(xù)，否則會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)結(jié)果的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中，冰敷組大鼠持續(xù)冰敷10d，對(duì)比次黃嘌呤灌胃加冰敷組，未出現(xiàn)死亡和嚴(yán)重不良反應(yīng)，但都有輕微不適，在停止實(shí)驗(yàn)3d后都恢復(fù)正常。

次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠右下肢膝關(guān)節(jié)的腫脹程度，與其它實(shí)驗(yàn)組之間都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），尤以第3～6天最為顯著（見圖1）。而步態(tài)評(píng)分亦顯示該組大鼠在第3～6天的活動(dòng)障礙最為明顯，至少表現(xiàn)為輕度跛行，多數(shù)大鼠表現(xiàn)為中度跛行。在實(shí)驗(yàn)過程中，從第1～10天，關(guān)節(jié)腫脹程度隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程有明顯波動(dòng)，出現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，這可能與高尿酸血癥建模中尿酸在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)累積的濃度有關(guān)［10］。在一定范圍內(nèi)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度應(yīng)與血尿酸濃度呈正相關(guān)。當(dāng)血尿酸濃度達(dá)到或超過尿酸的飽和度后即可析出并誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，且嚴(yán)重程度會(huì)隨濃度的增加而加重。如圖1所示，血尿酸濃度應(yīng)在第五天達(dá)高峰值，而后會(huì)隨著尿酸酶的代償性增多和活化而逐漸下降，最終與冰敷組相似。因此，在后期建模中加入尿酸酶抑制劑（如氧嗪酸）可能會(huì)有更好的效果9。

由于次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠在第10天出現(xiàn)2例死亡（2／6），所以被迫停止實(shí)驗(yàn)。停止實(shí)驗(yàn)3d后該組其它大鼠各項(xiàng)觀測(cè)數(shù)據(jù)比較正常組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），鏡下檢查大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)亦無差異，說明實(shí)驗(yàn)組大鼠已完全恢復(fù)，未能誘發(fā)慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。這可能是因?yàn)榇笫蟊旧砭邆淠蛩崦?，可以很好的矯正高尿酸血癥和清除沉積的尿酸結(jié)晶。初步認(rèn)為，如果無法建立穩(wěn)定的高尿酸血癥動(dòng)物模型就難以建立以此為基礎(chǔ)的慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。

綜上所述，重復(fù)次黃嘌呤灌胃和低溫處理大鼠膝關(guān)節(jié)可誘發(fā)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，與其它現(xiàn)有動(dòng)物模型相比更符合人類痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。該模型完全模擬人類由高嘌呤膳食和低溫環(huán)境誘發(fā)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制，且避免了關(guān)節(jié)腔注射等外界干擾因素，更適用于目前對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究，也可成為建立完美的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的基礎(chǔ)。

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