楊月峰，李澤良，魯茁壯，王華，肖鳳君，張群偉，孫慧燕，王立生

腺病毒載體具有宿主范圍廣、感染效率高、理化性質(zhì)穩(wěn)定、易制備高滴度病毒、不整合入細(xì)胞基因組等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療的基礎(chǔ)和臨床研究[1-3]。但是，第一代重組腺病毒載體存在包裝容量?。s 8 kb）、免疫源性強(qiáng)、目的基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間短等缺陷，嚴(yán)重阻礙了其臨床應(yīng)用[4-5]。近年來，在第一代重組腺病毒的基礎(chǔ)上，逐漸發(fā)展了第二代和第三代重組腺病毒載體。

第三代重組腺病毒載體，又稱輔助病毒依賴性腺病毒載體（helper-dependent adenoviral vectors，HD-Ad），去除了所有病毒編碼基因，僅保留了 5'和 3' 末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeat sequence，ITR）和包裝信號(hào)（ψ）[6]。因此，HD-Ad載體的包裝需要輔助病毒提供病毒復(fù)制、包裝等功能，而且，HD-Ad 載體的血清型由輔助病毒決定，采用不同血清型輔助病毒，可以實(shí)現(xiàn)血清型轉(zhuǎn)換[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，具有 Ad5 和 Ad11p 雜合纖維頂球的重組腺病毒 Ad5/F11p 可顯著提高對(duì)造血細(xì)胞，包括 K562、U937、Jurkat 等細(xì)胞系以及 CD34+細(xì)胞的感染效率[8]。為實(shí)現(xiàn) HD-Ad 對(duì)造血細(xì)胞的高效感染，本研究將以 Ad5/F11p 為基礎(chǔ)，構(gòu)建相應(yīng)的輔助腺病毒，并采用該輔助腺病毒包裝攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的第三代腺病毒 HD-Ad5/F11p-GFP；最后，在造血細(xì)胞中驗(yàn)證其高效感染能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和菌種 人胚腎 HEK293 細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（ATCC），培養(yǎng)于含10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養(yǎng)基中；穩(wěn)定表達(dá) Cre 重組酶的 293 細(xì)胞 293Cre4，培養(yǎng)于含10% FBS 和 0.4 mg/ml G418 的 α-MEM 培養(yǎng)基中；人白血病細(xì)胞系 K562、U937 和 Jurkat 為本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含 10% FBS 的 RPMI 1640培養(yǎng)基中；分離得到的人臍帶血 CD34+細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% FBS 的 IMDM 培養(yǎng)基中。輔助腺病毒H14、重組質(zhì)粒 pC4HSU-GFP 購自加拿大Microbix 公司；穿梭質(zhì)粒 pShuttle、大腸桿菌BJ5183 為本實(shí)驗(yàn)室保存；重組質(zhì)粒 pAd5/F11p 為本室構(gòu)建并保存[8]。

1.1.2 工具酶及主要試劑 T4 DNA 連接酶、PCR 反應(yīng)混合液、pMD-18T 載體、限制性內(nèi)切酶Bsp1407 I 和 Bgl II 購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶 Pme I 和 Pac I 購自美國NEB 公司；高保真 DNA 聚合酶 KOD-plus 購自日本 Toyobo 公司；感受態(tài)大腸桿菌 DH5α、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、脂質(zhì)體 2000 購自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Promega 公司；FBS 購自美國 Hyclone 公司；α-MEM、IMDM、RPMI 1640、DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；引物合成與測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 方法

設(shè)計(jì)以下 8 條引物（表 1），使用重疊 PCR 方法[10]合成 DNA 序列。具體方法為：將 8 條引物等摩爾混合后，擴(kuò)增 10 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)參數(shù)為 94 ℃3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，10 個(gè)循環(huán)；取出反應(yīng)產(chǎn)物 2.0 μl 作為模板，采用引物SynES-P1 和 SynES-P2，擴(kuò)增 25 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)參數(shù)為 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，25 個(gè)循環(huán)后 68 ℃ 延伸 5 min，擴(kuò)增片段長度為 241 bp，命名為 SynES。

1.2.2 含包裝信號(hào)重組 pShuttle-SynES 質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將上述擴(kuò)增獲得的 SynES 片段加 A后克隆到 pMD-18T 載體，得到 pMD-SynES，并測序鑒定正確；使用 Bsp1407 I 和 Bgl II 雙酶切pShuttle 和 pMD-SynES，分別回收 6600 bp 左右和 240 bp 左右的條帶，T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，kana+LB 平板篩選獲得pShuttle-SynES。以 SynES-P1 和 SynES-P6 為引物，進(jìn)行 PCR 鑒定，選取正確克隆進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3 輔助腺病毒 Ad5/F11p-HV 的制備和鑒定 Pme I 線性化 pShuttle-SynES 后，與 pAd5/F11p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞，Kana+LB 平板篩選獲得重組腺病毒質(zhì)粒；Pac I 鑒定正確后，采用脂質(zhì)體 2000 轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期HEK293 細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況；當(dāng)細(xì)胞完全病變后，收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融 3 次，離心得到病毒上清，即為原始病毒，命名為 Ad5/F11p-HV。

將病毒原液感染 293 細(xì)胞后，采用 Hirt 法提取病毒基因組 DNA，采用 SynES-P1 和 SynES-P6引物進(jìn)行 PCR 鑒定；大量擴(kuò)增獲得病毒粗提液，按照 CsCl 密度梯度離心法純化腺病毒；采用紫外分光光度法測定病毒顆粒滴度和純度，采用TCID50法測定病毒的感染滴度。

最后，對(duì)純化獲得的重組腺病毒進(jìn)行透射電鏡觀察。取純化的病毒上清 10 μl 滴加到載網(wǎng)上，1 min后取出載網(wǎng)用濾紙吸干病毒液，加磷鎢酸染色1 min，用濾紙吸干染色液，自然干燥，即可在電鏡下觀察。

1.2.4 輔助病毒依賴性重組腺病毒的制備 采用質(zhì)粒大量提取試劑盒提取攜 GFP 的骨架質(zhì)粒pC4HSU-GFP；取 10 μg 的重組質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶 Pme I 將其線性化；取含 5 μg pC4HSU-GFP的酶切產(chǎn)物，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染 6 cm 培養(yǎng)皿中 80% 左右融合度的 293Cre4 細(xì)胞，于 37 ℃，5% CO2的條件下孵育過夜；轉(zhuǎn)染后第 2 天，更換新鮮、預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，并添加 5 MOI 的輔助腺病毒 Ad5/F11p-HV 或 H14；48 h 后，細(xì)胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象，當(dāng)完全病變后，收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融 3 次后，離心去除細(xì)胞殘?jiān)?，獲得第一代病毒產(chǎn)物 HD-Ad5/F11p-GFP 或 HD-H14-GFP；取4 ml 的病毒產(chǎn)物和 1 MOI 的輔助病毒感染 15 cm培養(yǎng)皿中的 293Cre4 細(xì)胞，進(jìn)一步擴(kuò)增獲得第二代病毒產(chǎn)物；依次擴(kuò)增到第六代，收集病毒后，進(jìn)行 CsCl 密度梯度離心，可出現(xiàn)兩條帶，根據(jù)分子量可以確定，HD-Ad5/F11p-GFP 位于下層，輔助病毒 Ad5/F11p-HV 位于上層。

表1 重疊 PCR 合成包裝信號(hào)序列所需引物Table1 The primers for the synthesis of packaging signal sequences by using overlapping PCR

采用紫外分光光度法測定病毒顆粒滴度和純度；將 HD-Ad5/F11p-GFP 或HD-H14-GFP 按照不同稀釋倍數(shù)感染六孔板中的 293 細(xì)胞，于感染后48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測 GFP 的表達(dá)率，以表達(dá)率在 3%～30% 之間的稀釋度計(jì)算感染滴度，公式為：

感染滴度 =（感染時(shí)的細(xì)胞數(shù)×GFP 陽性率）/ 病毒體積×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 輔助病毒依賴性重組腺病毒對(duì)人白血病細(xì)胞的感染效率 將人白血病細(xì)胞 K562、U937 和Jurkat 以 2×105細(xì)胞/孔/0.5 ml 接種 24 孔板，分別加入 2 MOI 和 20 MOI 的重組腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP 和 HD-H14-GFP；感染后 24 h，加入 0.5 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基；感染后 48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測 GFP 的表達(dá)效率。

1.2.6 輔助病毒依賴性重組腺病毒對(duì)人臍帶血CD34+細(xì)胞的感染效率 將肝素抗凝的人臍帶血、0.5% 甲基纖維素和 PBS 按照 1∶1∶3 混合后，沉降紅細(xì)胞，收集上層液體，離心獲取細(xì)胞；將細(xì)胞用 PBS 重懸后，采用 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液富集并分離單個(gè)核細(xì)胞；采用 CD34+細(xì)胞磁珠分離試劑盒分離 CD34+細(xì)胞。分離得到的 CD34+細(xì)胞于 10% FBS 的 IMDM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將其按照 2×105細(xì)胞/孔/0.5 ml 接種 48 孔板，分別加入不同 MOI 的 HD-Ad5/F11p-GFP 或 HD-H14-GFP；感染后 48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測 GFP 的表達(dá)效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類型為“成組設(shè)計(jì)定量資料”，統(tǒng)計(jì)方法采用 t 檢驗(yàn)，以 P < 0.05 表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P < 0.01 表示具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒 pShutt1e-SynES 質(zhì)粒的構(gòu)建

采用重疊 PCR 方法成功擴(kuò)增出含有 A1-A4包裝信號(hào)和 loxP 序列，長度為 241 bp 的 DNA片段 SynES（圖 1A）。將其 3' 端加 A 后，回收相應(yīng)的 DNA 片段，并與 pMD-18T 載體連接，成功獲得重組質(zhì)粒 pMD-SynES，并測序鑒定正確。Bsp1407 I 和 Bgl II 雙酶切 pMD-SynES，獲得SynES 片段；將其克隆到 pShuttle 載體的相應(yīng)位點(diǎn)，經(jīng) PCR 鑒定正確（圖 1B），表明重組質(zhì)粒pShuttle-SynES 已成功構(gòu)建。

圖1 重組質(zhì)粒 pShuttle-SynES 的構(gòu)建Figure1 Construction of recombinant plasmid pShuttle-SynES

圖2 重組腺病毒 Ad5/F11p-HV 的鑒定Figure2 Identification of recombinant adenovirus Ad5/F11p-HV

2.2 重組輔助腺病毒 Ad5/F11p-HV 的制備

Pme I 線性化的重組質(zhì)粒 pShuttle-SynES 和pAd5/F11p 共轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BJ5183，同源重組，成功獲得重組腺病毒質(zhì)粒 pAd5/F11p-HV，并經(jīng)Pac I 酶切鑒定。將線性化的 pAd5/F11p-HV 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后，8 d 可見噬斑形成，11 d 出現(xiàn)完全病變，收集獲得病毒原液，該病毒命名為 Ad5/F11p-HV。

提取病毒基因組 DNA 后，采用 PCR 方法鑒定病毒基因組 DNA，結(jié)果顯示，已成功將目的基因克隆到病毒基因組 DNA中（圖 2A）。經(jīng)大量擴(kuò)增和 CsCl 密度梯度離心后，得到純化的病毒產(chǎn)物，經(jīng)負(fù)染后電鏡觀察顯示，病毒具有典型的二十面體立體對(duì)稱，直徑約為 80 nm，表面排列有整齊殼粒的腺病毒樣離子（圖 2B）。采用 TCID50檢測，獲得病毒的感染滴度為 1×1010IU/ml，感染滴度與顆粒滴度的比值大于 1/50。

2.3 輔助依賴性重組腺病毒的制備

攜帶 GFP 的骨架質(zhì)粒載體 pC4HSU-GFP 轉(zhuǎn)染 293Cre4 細(xì)胞后，在輔助腺病毒 Ad5/F11p-HV的協(xié)助下，制備獲得輔助病毒和輔助依賴性腺病毒的混合病毒。將其感染 293 細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見 GFP 的表達(dá)，表明已經(jīng)成功獲得了輔助依賴性重組腺病毒 HD-Ad5/F11p-GFP（圖 3A）。對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增后，采用 CsCl 密度梯度離心純化病毒，可見明顯的兩條條帶，根據(jù)分子量判斷，下層為目的條帶 HD-Ad5/F11p-GFP，上層為輔助病毒Ad5/F11p-HV 條帶（圖 3B）。

利用輔助病毒 H14 制備并純化獲得了對(duì)照病毒 HD-H14-GFP。進(jìn)一步對(duì)其顆粒滴度、感染滴度和純度進(jìn)行了鑒定（表 2），結(jié)果表明，成功獲得合格的病毒產(chǎn)物。由表 2 結(jié)果計(jì)算可得，擴(kuò)增獲得的HD-Ad5/F11p-GFP 總量為 5.17×1010IU/40 皿，而 HD-H14-GFP 的總量則為 4.32×1010IU/40 皿，表明 Ad5/F11p-HV 包裝獲得的第三代腺病毒產(chǎn)量更高。

2.4 HD-Ad5/F11p-GFP 對(duì)人白血病細(xì)胞系的感染效率

圖3 輔助依賴性重組腺病毒的制備和鑒定Figure3 Preparation and identification of helper-dependent adenoviruses

表2 輔助依賴性重組腺病毒的滴度和純度測定結(jié)果Table2 The purity and titers of helper-dependent adenoviruses

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測人白血病細(xì)胞系中綠色熒光蛋白的表達(dá)Figure4 The expression of GFP, detected by flow cytometry, in cell lines derived from human leukemia

為明確 HD-Ad5/F11p-GFP 對(duì)人白血病細(xì)胞系的感染效率，將 HD-Ad5/F11p-GFP 和對(duì)照病毒HD-H14-GFP 分別以 2 MOI 和 20 MOI 的感染強(qiáng)度感染 K562、U937 和 Jurkat 細(xì)胞，結(jié)果顯示，與 HD-H14-GFP 相比，HD-Ad5/F11p-GFP 可明顯提高對(duì)人白血病細(xì)胞系的感染效率（圖 4 和表 3）。

2.5 HD-Ad5/F11p-GFP 對(duì)臍帶血來源 CD34+ 細(xì)胞的感染效率

為明確 HD-Ad5/F11p-GFP 對(duì)造血細(xì)胞的高效感染能力，以 200 MOI的感染強(qiáng)度感染臍帶血來源的 CD34+細(xì)胞。48 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測 GFP的表達(dá)效率。共檢測了兩份標(biāo)本，結(jié)果如圖 5 所示，表明 HD-Ad5/F11p-GFP 對(duì) CD34+細(xì)胞具有較高的感染效率。

表3 20 MOI 重組腺病毒 HD-Ad5/F11p-GFP或 HD-H14-GFP 感染后 48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)Table3 The expression of GFP, detected by flow cytometry 48 h post-infection of 20 MOI HD-Ad5/F11p-GFP or HD-H14-GFP, in cell lines derived from human leukemia

3 討論

第三代重組腺病毒載體由于缺失病毒編碼序列，載體的包裝能力得到了極大的提高，可達(dá)到36～37.3 kb，可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因、大分子蛋白，甚至可以添加多個(gè)基因表達(dá)的調(diào)控因子，從而進(jìn)一步拓寬了重組腺病毒載體的應(yīng)用范圍[11-12]。但是，由于第三代腺病毒缺失除包裝信號(hào)和兩端的 ITRs以外的所有腺病毒基因組序列，其殼體的生成和包裝均需細(xì)胞內(nèi)的輔助病毒反向提供。由于輔助病毒和第三代腺病毒具有相同的殼體，所以在純化前必須將兩者分離，并盡量減少輔助病毒的包裝效率。為此，本研究首先利用不完全包裝信號(hào)和包裝信號(hào)的突變減少輔助病毒包裝序列；其次，通過Cre/loxP 系統(tǒng)，在輔助病毒包裝信號(hào)的兩側(cè)引入loxP 序列，在包裝細(xì)胞 293Cre4 中，可通過 Cre酶的表達(dá)剪切包裝信號(hào)，從而減少輔助病毒的包裝；第三，構(gòu)建的輔助腺病毒 Ad5/F11p-HV 的基因組大小為 29444 bp，位于第三代腺病毒的上層，方便通過 CsCl 密度梯度離心分離。

圖5 200 MOI 輔助依賴性重組腺病毒感染 CD34+ 細(xì)胞后，GFP 表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Figure5 The expression of GFP, detected by flow cytometry, in CD34+ cells infected with 200 MOI HD-Ad5/F11p-GFP or HD-H14-GFP

目前已發(fā)現(xiàn)超過 50 種血清型的重組腺病毒，其中，5 型腺病毒在基因治療中的應(yīng)用最為廣泛。5 型腺病毒可特異識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞表面的柯薩奇病毒-腺病毒受體（coxsackie-adenovirus receptor，CAR），進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞。但是，造血細(xì)胞表面的 CAR表達(dá)較低，進(jìn)而影響其感染效率。B 組腺病毒（包括 Ad3、Ad11p、Ad35 等）可通過識(shí)別 CD46 分子進(jìn)入細(xì)胞，而造血細(xì)胞中 CD46 分子表達(dá)效率高。研究表明，具有 5 型腺病毒和 B 組腺病毒雜合纖維頂球的重組腺病毒 Ad5/F11p、Ad3/5 和Ad5/35 等，對(duì)造血細(xì)胞的感染效率明顯提高[8,13-14]。本研究以 Ad5/F11p 為基礎(chǔ)構(gòu)建了輔助腺病毒Ad5/F11p-HV，包裝獲得的第三代腺病毒 HD-Ad5/F11p-GFP可明顯提高對(duì)人白血病細(xì)胞系和臍帶血CD34+細(xì)胞的感染效率。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了輔助腺病毒Ad5/F11p-HV，并采用該腺病毒包裝獲得具有造血細(xì)胞高效感染能力的第三代腺病毒，有望為第三代腺病毒在造血細(xì)胞基因治療中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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