龍鳳 ，仇瑋祎，常旭，林建波，朱恒奇，張景海，王雙

1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.棗莊市婦幼保健院，山東 棗莊 277100

Hedgehog（HH）家族蛋白及其信號通路在哺乳動物胚胎發(fā)育和組織發(fā)生中發(fā)揮重要作用，影響著細(xì)胞間識別、增殖及細(xì)胞命運(yùn)等眾多生理過程。其中，SHH（sonic hedgehog，SHH）對哺乳動物的乳腺、前列腺、肺、毛發(fā)和神經(jīng)系統(tǒng)等多種器官的發(fā)育有重要作用[1]。HH 信號通路在慢性炎癥的組織修復(fù)和癌癥發(fā)生中也發(fā)揮著重要作用[2]，研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤包括基底細(xì)胞癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、髓母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的發(fā)生和惡化都與SHH 信號通路密切相關(guān)[3]。因此，以SHH 及其通路分子作為靶標(biāo)，研制抗體或小分子抑制劑，通過阻斷其與受體的結(jié)合，或抑制受體介導(dǎo)的信號通路，對于相關(guān)疾病的治療具有非常重要的意義。在此，我們以SHH 為研究對象，選取其與受體結(jié)合的N 端（SHH-N）197和200個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域，分別將其基因克隆入真核瞬時表達(dá)載體，在HEK293T 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)，利用His 標(biāo)簽進(jìn)行純化，獲得高純度的SHH-N 蛋白，為抗SHH 中和抗體及小分子抑制劑的研制提供抗原。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 細(xì)胞、pL293 載體質(zhì)粒由本室保存；大腸桿菌DH5α、Tag酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；人Shh基因全長克隆購自義翹神州生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamH 及T4DNA連接酶購自NEB公司；pfu酶購自Promega 公司；dNTP購自寶生物工程公司；SHH單抗購自Sigma公司；HRP 標(biāo)記的羊抗人二抗購自中杉金橋公司；NiNTA 柱（型號His Trap FF）購自GE 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物合成及測序由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所完成。

1.2 重組人SHH-N表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

采用PCR 方法從所購人ShhcDNA 克隆中獲得SHH 蛋白N 端編碼序列600 bp 片段，并在PCR 引物中引入His 標(biāo)簽的編碼序列。上游引物為5'-CGG AATTCGCCGCCACCATGCTGCTGCTGGCGAGATG-3'，下游引物為5'-CGGGATCCTCAATGGTGATGGT GATGGTGGCCTCCCGATTTGGCCGCC-3'，下劃線處分別為引入的EcoRⅠ和BamHⅠ限制酶作用位點(diǎn)。將PCR 產(chǎn)物和pL293真核表達(dá)載體同時進(jìn)行雙酶切（37℃2 h），用DNA 凝膠試劑盒回收相應(yīng)的基因和載體片段，經(jīng)T4DNA 連接酶連接后得到重組質(zhì)粒pL293-Shh-N，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌涂布于含100μg/mL 氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基平板上，37℃孵育過夜，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行序列測定。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

將純化的質(zhì)粒pL293-Shh-N 轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，同時以載體質(zhì)粒pL293 轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞作為對照。轉(zhuǎn)染前2 d，將7.5×104細(xì)胞轉(zhuǎn)接于30 mL 新鮮培養(yǎng)基中，在125 mL 搖瓶中培養(yǎng)，最終細(xì)胞濃度為0.25×106/mL，細(xì)胞總數(shù)為3×107。2 d 后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到（1.0～1.2）×106/mL 時，將30μg 質(zhì)粒與脂質(zhì)體輕柔混合，逐滴加入30 mL細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)3 d，4℃、2000 r/min離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.4 重組蛋白的純化

將表達(dá)上清用Ni-NTA 柱純化，純化步驟參考產(chǎn)品說明書，用500 mmol/L 咪唑洗脫得到所需蛋白，并將其脫鹽于pH7.4 的PBS 中，SDS-PAGE 觀察條帶，并采用Bradford法對純化的蛋白進(jìn)行定量。

1.5 純化產(chǎn)物的ELISA鑒定

將純化的SHH-N 蛋白樣品包被ELISA 板，200 ng/孔，4℃過夜后用PBS 洗滌3 次，用脫脂奶粉于室溫封閉2 h 后加入兔抗人SHH 抗體（1∶50），37℃作用1 h，用PBS 徹底洗滌，再與HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗，1∶2000）于37℃相互作用1 h，用PBS充分洗滌后加入OPD 染色，室溫顯色5～10 min 后加入50μL 2 mol/L H2SO4終止液終止顯色，用分光光度計檢測D492nm/D630nm值。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒pL293-Shh-N的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報道，SHH-N 蛋白（1～200 殘基）含有受體結(jié)合區(qū)域。本研究選擇1～197和1～200 氨基酸殘基為目的蛋白序列。從含Shh全長基因的質(zhì)粒中，經(jīng)PCR 分別獲得SHH-N 端編碼序列591和600 bp 片段，電泳結(jié)果顯示其大小與預(yù)期相符（圖1A）。2 條PCR 片段通過EcoRⅠ和BamHⅠ分別克隆入表達(dá)載體質(zhì)粒pL293，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pL293-Shh591-his和pL293-Shh600-his，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確（圖1B），測序結(jié)果表明基因克隆正確無誤。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化

圖1 Shh基因片段PCR產(chǎn)物（A）和重組質(zhì)粒的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切鑒定（B）瓊脂糖電泳圖

收集轉(zhuǎn)染3 d 后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，用鎳離子柱進(jìn)行純化，用60 mmol/L 咪唑洗滌2 次，500 mmol/L咪唑洗脫。各步驟產(chǎn)物行SDS-PAGE。結(jié)果表明，500 mmol/L 咪唑可將SHH-591-His和SHH-600-His 洗脫下來，獲得純度較高的目的蛋白，表觀相對分子質(zhì)量約為20×103。SHH-591-His蛋白的表達(dá)水平明顯高于SHH-600-His（圖2）。

2.3 SHH-591-His的Western印跡

進(jìn)一步對純化的SHH-591-His 蛋白進(jìn)行Western印跡，結(jié)果見圖3，與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清相比，其在相對分子質(zhì)量約20×103處有2 條特異性表達(dá)條帶，與預(yù)期分子大小相符，其中表觀分子質(zhì)量相對較大的條帶應(yīng)為糖基化的SHH-591-His。

2.4 表達(dá)純化產(chǎn)物的ELISA鑒定

分別用抗His標(biāo)簽抗體和抗SHH-N中和抗體對相同濃度的純化產(chǎn)物進(jìn)行ELISA分析，以含有His標(biāo)簽的重組VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）為對照，結(jié)果見圖4。SHH-591-His、SHH-600-His 及含His 標(biāo)簽的對照蛋白VEGF 均可特異性結(jié)合抗His標(biāo)簽抗體，而SHH-591-His 與抗SHH 中和抗體的結(jié)合能力卻明顯高于SHH-600-His，提示其在結(jié)構(gòu)上可能更接近于天然SHH，更適合作為研制功能抗體的抗原蛋白分子。

3 討論

圖2 SHH重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE

SHH 蛋白是一種高度保守的分泌型糖蛋白，屬于細(xì)胞外配體。SHH 蛋白全長包含462 個氨基酸殘基，由N 端（1～197 殘基）和C 端（SHH-C，198～462 殘基）2個結(jié)構(gòu)域組成，其中SHH-N具有與受體結(jié)合并激活其下游信號通路的活性，而SHH-C 則具有自身蛋白水解酶活性和膽固醇轉(zhuǎn)移酶功能，負(fù)責(zé)前體分子的自我加工[4]。SHH 全長分子又稱SHH 前體蛋白，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過C端自催化作用分裂成SHHN和SHH-C 兩部分，后者可將其上共價結(jié)合膽固醇分子轉(zhuǎn)移到SHH-N 的半胱氨酸殘基上，使之發(fā)生棕櫚?；?，從而使SHH-N 成為具有完全生物學(xué)功能的成熟蛋白[5]。研究證實(shí)，將Shh基因5'端的600 bp核苷酸序列整合入pIRES2-EGFP 載體后轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，獲得了具有生物學(xué)功能的成熟SHH-N。因此我們認(rèn)為，雖然缺少C 端棕櫚?；糠?，但真核表達(dá)的SHH-N 蛋白仍具有SHH 足夠的生物學(xué)功能，可以作為中和抗體篩選的誘餌抗原[6]。

目前，國內(nèi)已發(fā)表的SHH-N 蛋白表達(dá)方式有原核表達(dá)[7]和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)[8]，其糖基化修飾與真核表達(dá)仍有差距；而腺病毒或慢病毒表達(dá)系統(tǒng)步驟復(fù)雜，表達(dá)量低，適用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后功能方面的研究，但不適于抗原制備[9-10]。由于SHH-N 具有糖基化修飾，選擇真核表達(dá)系統(tǒng)將更好地保證其生物學(xué)活性，本研究結(jié)果也證實(shí)其的確具有一定程度的糖基化。由于其1～197 殘基為報道的SHH-N 序列，但有研究者表達(dá)了1～200 殘基，因此，在本研究中，我們也分別表達(dá)了1～197和1～200 殘基2 種截短體。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SHH-600 的表達(dá)量明顯低于SHH-591，且SHH-591與SHH 中和抗體的結(jié)合活性明顯高于SHH-600，提示SHH-591 的結(jié)構(gòu)更適合作為蛋白抗原。本研究為以SHH 為靶點(diǎn)的中和抗體研制奠定了基礎(chǔ)。

圖3 SHH-591-His蛋白的Western印跡

圖4 SHH-591-His和SHH-600-His的ELISA結(jié)合活性分析

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