張慶，王青青，鞠建松，徐書景

河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024

近年來，四氫嘧啶（ectoine，E）及其衍生物5-羥化四氫嘧啶（hydroxyectoine，HE）在微生物細(xì)胞中作為滲透相溶性物質(zhì)已被廣泛研究，它們不僅具有與其他相容性物質(zhì)（如甜菜堿、糖、氨基酸及其衍生物、多元醇等）相同的滲透調(diào)節(jié)作用，還具有在冷凍、高溫、干燥及氧自由基環(huán)境中保護(hù)細(xì)胞膜、維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的性能[1-2]。雖然四氫嘧啶和5-羥化四氫嘧啶在結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，作用方面也有很多相似之處，但最近的研究顯示5-羥化四氫嘧啶對蛋白的保護(hù)作用要優(yōu)于四氫嘧啶和其他相溶性物質(zhì)[3]。

目前5-羥化四氫嘧啶已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、生物制造、化工等行業(yè)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，5-羥化四氫嘧啶不僅可以加入藥物中用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，也可作為化療時健康細(xì)胞的保護(hù)劑[5]。Harishchan?dra等發(fā)現(xiàn)，5-羥化四氫嘧啶還具有增強(qiáng)人工肺表面活性劑的作用[6]。此外，5-羥化四氫嘧啶還能提高雙鏈DNA的解鏈溫度，可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的增強(qiáng)劑[7]。

四氫嘧啶羥化酶（ectoine hydroxylase，EctD）主要負(fù)責(zé)將四氫嘧啶羥基化，轉(zhuǎn)化為5-羥化四氫嘧啶，屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶超家族（EC 1.14.11）[8-9]。自從發(fā)現(xiàn)EctD以來，國內(nèi)外學(xué)者對EctD產(chǎn)生菌做了廣泛研究。李巖等從極端耐鹽放線菌中克隆獲得5-羥基四氫嘧啶合成相關(guān)基因ectABCD，并分析了這些基因?qū)暝诟啕}脅迫中的作用[10]；Reuter等從需鹽枝芽孢桿菌（Virgibacil?lus salexigens）中克隆獲得目的基因ectD，并對其蛋白晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理進(jìn)行了解析[11]。我們將就EctD的基因來源、功能、結(jié)構(gòu)及活性中心等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合分析。

1 四氫嘧啶羥化酶的來源

擁有ectD基因的微生物在生理、生活方式和棲息地分類上相對多樣化，它們中有的來自病原菌，如膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus）和波氏桿菌屬（Bordetella)的多個菌株；有的來自在抗生素生產(chǎn)方面具有重要作用的微生物，如天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）和灰色鏈霉菌（S.griseus）；有的是生長在極低或極高溫度環(huán)境中的細(xì)菌，如嗜熱芽孢桿菌（Geobacillus sp.Y412MC10）和嗜冷鞘脂單胞菌（Sphingopyxis alaskensis），以及生長在極端pH環(huán)境中的細(xì)菌，如歐氏堿湖生菌（Alkalilimnicola ehrlichei）；大部分擁有ectD基因的微生物生長在高鹽或海洋環(huán)境中，如海洋細(xì)菌泊庫島食烷菌（Alca?nivorax borkumensis SK2）[11]。

Bursy等通過氨基酸序列比對檢索發(fā)現(xiàn)，有46株革蘭陽性或陰性菌的EctD與需鹽枝芽孢桿菌的EctD的氨基酸同源性高達(dá)61%～73%，其中ectD基因位于ectABC基因簇下游的有30種，而剩余的16株中ectD基因并不與ectABC基因相連[9]。ectD基因片段的大小隨菌株來源不同而不等，一般約為1 kb，如來自需鹽色鹽桿菌（Chromohalobacter salexigens）的 ectD-1基因?yàn)?996 bp（GenBank：ABE60347.1），ectD-2基因?yàn)?942 bp（GenBank：ABE57904.1），而來源于需鹽枝芽孢桿菌的ectD基因?yàn)?00 bp（Gen?Bank：AAY29689.1）[11]。盡管不同來源的EctD的氨基酸序列同源性有所不同，但它們的保守位點(diǎn)，如與2-酮戊二酸及Fe2+的結(jié)合位點(diǎn)基本相同（圖1），說明ectD基因在進(jìn)化上是相對保守的[1-11]。

序列同源性比對檢索發(fā)現(xiàn)，ectD與脯氨酸羥化酶基因、人類植烷酸-輔酶A羥化酶（phytanoyl-CoA hydroxylase，PhyH）基因具有較高的同源性，同屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶超家族，都存在結(jié)合Fe2+的保守2-His-1-羧酸酯面三聯(lián)體[9]。不同來源的EctD與指孢囊菌RH1中L-脯氨酸-4-羥化酶（GenBank：D78338.1）的氨基酸序列同源性為26%～32%[12]。由于以上原因，ectD基因常被誤認(rèn)為脯氨酸羥化酶基因或植烷酸-輔酶A羥化酶基因[2]。

2 四氫嘧啶羥化酶的催化反應(yīng)機(jī)理

EctD屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶，該家族的酶普遍存在于原核和真核微生物中，能催化多種氧化反應(yīng)，包括環(huán)化反應(yīng)、環(huán)碎裂、C-C鍵斷裂、降低氧飽和度、鹵化及羥化反應(yīng)等[13-14]。在四氫嘧啶羥基化反應(yīng)中，共底物2-酮戊二酸脫去羧基釋放一個CO2分子從而形成琥珀酸，同時，氧分子中的一個氧原子被納入琥珀酸鹽，而另一個氧原子形成羥基插入四氫嘧啶從而形成5-羥化四氫嘧啶[9]。

3 四氫嘧啶羥化酶的活性檢測方法

目前EctD的活性檢測方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[15]。四氫嘧啶及羥化四氫嘧啶的檢測以乙腈/水（80/20，V/V）為流動相，流速為1.0 mL/min，在210 nm處檢測吸收峰[16]。底物四氫嘧啶及產(chǎn)物羥化四氫嘧啶可以采用C18柱通過紫外檢測器直接檢測[17]，也可以通過Fmoc-Cl柱前衍生，采用NH2柱通過熒光檢測器檢測[15]，根據(jù)底物和產(chǎn)物的峰面積計算EctD的催化效率[9]。

雖然EctD的來源很廣，但其催化條件基本相似，催化過程中都需要氧氣（劇烈振蕩）、FeSO4、α-酮戊二酸及L-抗壞血酸。Bursy等發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)中僅需要低濃度的FeSO4和抗壞血酸，F(xiàn)eSO4濃度超過1 mmol/L會對EctD的活性產(chǎn)生抑制作用，同樣，5 mmol/L抗壞血酸對EctD的活性抑制作用達(dá)70%，而加入過氧化氫酶則有利于提高酶催化活性，加入1.3 kU的過氧化氫酶可使酶蛋白的催化效率提高5倍[9]。Bursy等對來自天藍(lán)色鏈霉菌（S.coelicolor）A3（2）和需鹽枝芽孢桿菌的EctD的酶學(xué)特性進(jìn)行了表征，分析表明二者的催化條件基本相似，對底物四氫嘧啶和2-酮戊二酸的親和常數(shù)Km也基本相當(dāng)[8]。

將四氫嘧啶的2種衍生物，五元環(huán)化合物［（RS）-4，5-dihydro-2-methyl-imidazole-4-carbox?ylic acid］及七元環(huán)化合物homoectoine［（S）-4，5，6，7-tetrahydro-2-methyl-1H-（1，3）-diazepine-4-carboxylic acid］作為底物，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)并沒有得到其羥化產(chǎn)物，說明EctD具有高度的底物專一性，僅對四氫嘧啶（六元環(huán)化合物）具有催化活性[9]。

圖1 四氫嘧啶羥化酶與脯氨酸羥化酶的同源序列比對（部分）

4 四氫嘧啶羥化酶的空間結(jié)構(gòu)

雖然EctD廣泛存在于各種革蘭陰性和陽性細(xì)菌中，其產(chǎn)物5-羥化四氫嘧啶作為相溶性物質(zhì)也被廣泛研究，但有關(guān)EctD空間結(jié)構(gòu)的報道卻很少。目前僅有來自需鹽枝芽孢桿菌的EctD蛋白結(jié)構(gòu)得到解析（PDB no.3EMR）[11]。從解析的結(jié)構(gòu)來看，EctD蛋白以單體形式存在，與其他非血紅素鐵（Ⅱ）和2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的成員一樣，其蛋白結(jié)構(gòu)的核心部分由雙鏈β-螺旋和一些穩(wěn)定的α-螺旋組成。它由鏈β-Ⅰ、β-Ⅱ、β-Ⅲ、β-Ⅳ、β-Ⅴ、β-Ⅵ、β-Ⅶ和β-Ⅷ組成，其中β-Ⅱ、β-Ⅳ、β-Ⅴ和β-Ⅶ形成曲折的片段，組成所謂的短鏈，而主要片段則由β-I、β-Ⅲ、β-Ⅵ和β-Ⅷ組成。EctD中的主要片段兩側(cè)的延伸由反平行鏈β-2、β-3和β-4組成。

4.1 Fe2+結(jié)合位點(diǎn)

非鐵紅素和2-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶家族的酶促功能主要取決于高度活潑的鐵離子。在需鹽枝芽孢桿菌EctD的活性中心，氨基酸殘基His146、Asp148和His248的功能基團(tuán)（2個咪唑基團(tuán)和1個羧基基團(tuán)）與Fe2+結(jié)合形成所謂的2-His-1-羧酸酯面三聯(lián)體[11-18]。Widderich等將這些位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后，不僅導(dǎo)致突變體蛋白H146A、D148A和H248A完全喪失了酶學(xué)活性，而且在突變體蛋白中也不再含有鐵離子，與之相反的是，每摩爾野生型EctD中含有0.9 mol的鐵離子，這些結(jié)果證明氨基酸殘基His146、Asp148和His248是酶蛋白結(jié)合鐵離子及酶活性所必需的[18]。

4.2 2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)

在所有含非還原性亞鐵離子和2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶中，共底物2-酮戊二酸結(jié)合于酶蛋白活性中心底部，并通過其1-羧基基團(tuán)和2-氧代基團(tuán)參與協(xié)調(diào)亞鐵離子與酶的結(jié)合，其5-羧基基團(tuán)則通過與精氨酸或賴氨酸的側(cè)鏈堿性基團(tuán)形成的鹽橋及與氨基酸殘基的羥基形成氫鍵而穩(wěn)定結(jié)合[18-19]。

由于至今還沒有得到EctD與2-酮戊二酸的復(fù)合物晶體，2-酮戊二酸與EctD的結(jié)合位點(diǎn)只能通過比較EctD的配體結(jié)合口袋及其他雙加氧酶的結(jié)構(gòu)來推測。McDonough等對與EctD最接近的PhyH蛋白結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，Ser266的羥基基團(tuán)與2-酮戊二酸相互作用[20]；通過對71個EctD類蛋白序列比對，Ruter等發(fā)現(xiàn)需鹽枝芽孢桿菌來源的EctD中Ser250位點(diǎn)與PhyH中Ser266位點(diǎn)相對應(yīng)，該位點(diǎn)嚴(yán)格保守，位于與亞鐵離子螯合的His248之后，Ruter等推測EctD中Ser250的醇羥基可能與2-酮戊二酸的5-羧基基團(tuán)相互作用[11]。隨后，Widderich等通過對185個EctD類蛋白序列進(jìn)行比對及PhyHD1A（PDB no.2OPW）和2-酮戊二酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)EctD中氨基酸位點(diǎn)Arg259、Ser250和Phe143與PhyHD1A中2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)相對應(yīng)，將這些位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后均導(dǎo)致酶蛋白活性喪失，說明EctD中2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)由 Arg259、Ser250和 Phe143構(gòu)成[18]。此外，Wid?derich等發(fā)現(xiàn)，除了上述與2-酮戊二酸結(jié)合的3個位點(diǎn)外，Arg131也和2-酮戊二酸分子存在相互作用，其側(cè)鏈與Phe95及Asn133的側(cè)鏈形成陽離子-π相互作用，從而使其穩(wěn)定存在于結(jié)合配體的孔穴之中，起到了維持EctD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，一旦失去了這個相互作用就會導(dǎo)致EctD活性中心更加開放，導(dǎo)致酶蛋白不能結(jié)合底物。Widderich等將上述3個氨基酸位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后，所得突變體蛋白完全喪失了活性，證明這些位點(diǎn)和2-酮戊二酸之間存在相互作用[18]。因此，可以說EctD中2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)由Arg259、Ser250、Phe143、Arg131、Asn133和 Phe95構(gòu)成。

4.3 四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)

同樣，由于至今還沒有得到EctD與底物（四氫嘧啶）或產(chǎn)物（5-羥化四氫嘧啶）的復(fù)合物晶體，底物和EctD的結(jié)合位點(diǎn)尚無法確定[11]。Widderich等通過分子動力學(xué)模擬技術(shù)（molecular dynamics simula?tions）對需鹽枝芽孢桿菌來源的EctD分析發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶位于由氨基酸殘基 Gln129、Trp152、Ser165、Phe242和Phe263組成的口袋中，其與各氨基酸殘基側(cè)鏈間的距離為5～6 ?；此外，四氫嘧啶的甲基基團(tuán)指向位于口袋底部的Ser130的主鏈（甲基基團(tuán)與Ser130的Cα間的距離小于5 ?），其羧基基團(tuán)和Ser165的側(cè)鏈形成氫鍵（二者間距離小于3.2 ?），并導(dǎo)致四氫嘧啶分子的脒基和殘基Gln129側(cè)鏈以氫鍵結(jié)合；而從185個EctD類蛋白序列比對結(jié)果可以看出，上述6個氨基酸位點(diǎn)均高度保守。因此，Widderich等推測這些氨基酸殘基可能是酶蛋白EctD的底物結(jié)合位點(diǎn)[18]。

為了證實(shí)四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測的結(jié)果，Widd?erich等構(gòu)建了一系列定點(diǎn)突變體：將氨基酸殘基Gln129、Trp152、Phe242和 Phe263分別突變?yōu)?Ala，所獲得的突變體酶蛋白的活性均完全喪失，而Ser165突變?yōu)锳la僅使酶蛋白的活性功能受到較大程度的限制；進(jìn)一步將Trp152突變?yōu)镻he或Tyr后，突變體同樣失去了蛋白活性，這個結(jié)果和通過分子動力學(xué)模擬所構(gòu)建的模型相一致，說明四氫嘧啶分子與Trp152側(cè)鏈上的苯環(huán)相互作用，氨基酸置換使該位點(diǎn)側(cè)鏈?zhǔn)ケ江h(huán)后導(dǎo)致突變體蛋白無法和四氫嘧啶結(jié)合，從而使蛋白喪失活性。同樣，將Phe242和Phe263突變?yōu)門yr后導(dǎo)致突變體酶蛋白活性大幅下降，而突變?yōu)門rp后則活性完全喪失，說明四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)不能進(jìn)行較大的結(jié)構(gòu)上的修改，尤其是插入含有大體積側(cè)鏈的色氨酸殘基。Widderich等還對一些側(cè)鏈遠(yuǎn)離酶蛋白催化中心或伸向cupin桶狀結(jié)構(gòu)但并不與配體相互作用的氨基酸殘基進(jìn)行突變，如位于柔性loop區(qū)域的Pro198和Ser205等，這些位點(diǎn)突變后突變體酶蛋白仍然保持活性。由此可以說明氨基酸殘基Gln129、Ser130、Ser165、Trp152、Phe242及 Phe263是與底物四氫嘧啶相結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[18]。

5 展望

EctD的催化產(chǎn)物5-羥化四氫嘧啶作為相容性物質(zhì)已受到廣泛關(guān)注，它存在于很多細(xì)菌中，提高細(xì)胞內(nèi)的水活度，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，保證細(xì)胞正常的代謝活動[16]。Rodríguez-Moya等將需鹽色鹽桿菌四氫嘧啶合成基因簇ectABC和ectD串聯(lián)表達(dá)，提高了5-羥化四氫嘧啶的生成量，細(xì)胞對許多環(huán)境刺激因素（高鹽、溫度、鐵離子、外部滲透劑、DNA促旋酶抑制劑萘啶酸等）的耐受性也得到了提高[21]。目前，利用EctD轉(zhuǎn)化生成5-羥化四氫嘧啶也受到科研工作者的重視。Eilert等將伸長鹽單胞菌（Halomonas elongata）中5-羥化四氫嘧啶合成基因簇ectA、ectB、ectC和ectD插入漢遜酵母（Hansenula polymorpha）基因組后，所構(gòu)建工程菌株的5-羥化四氫嘧啶轉(zhuǎn)化率接近100%，發(fā)酵液中產(chǎn)物達(dá)到2.8 g/L[22]?？梢钥闯?，目前在EctD的開發(fā)利用方面得到了比較充分的研究。不過，有關(guān)該酶的空間結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理方面的研究還比較少，迄今僅有來自需鹽枝芽孢桿菌的EctD晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理得到了解析和研究，這方面的工作還有待進(jìn)一步完善。此外，可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將ectD基因插入工程菌株或轉(zhuǎn)基因植物中，以提高工程菌株和轉(zhuǎn)基因植物對高鹽、高溫、干燥、冰凍等環(huán)境刺激因素的耐受性。

EctD和脯氨酸羥化酶都屬于Fe2+、2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶超家族，相互間序列同源性較高，與底物及配體的結(jié)合位點(diǎn)高度保守，Widderich等將脯氨酸羥化酶歸類于EctD類酶蛋白[18]，因此，我們推測二者或許具有相似的催化功能。由于羥脯氨酸可作為各種軟組織疾病的藥物，還可加快傷口愈合，治療各種皮膚疾病，它還是合成多種藥物的原料，如第三代抗生素，抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等，因此，羥脯氨酸的生物合成具有廣闊的發(fā)展前景[23-24]。但是，由于當(dāng)前采用的脯氨酸羥化酶主要來自指囊孢菌，該酶基因中的GC含量過高（73.9%），影響酶蛋白的可溶性表達(dá)，且該酶的催化活性低，反應(yīng)時間長，產(chǎn)率較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[23]。本實(shí)驗(yàn)室從鹽湖樣品中克隆獲得了一個ectD基因，所編碼酶蛋白以可溶性形式大量表達(dá)，活性檢測發(fā)現(xiàn)該酶具有微弱的羥脯氨酸轉(zhuǎn)化能力；參照已解析的EctD和脯氨酸羥化酶三維結(jié)構(gòu)信息，分析酶蛋白的活性中心及配體結(jié)合位點(diǎn)，通過基因工程技術(shù)合理改造EctD，以獲得可溶性好且對脯氨酸催化效率高的理想酶蛋白。

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