胡岸 ，吳婷，陳翀，檀英霞，張士坤，冷泠，李素波，高紅偉，季守平

1.中南大學 生物科學與技術(shù)學院，湖南 長沙 410012；2.軍事醫(yī)學科學院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850

核酸疫苗是一種新型疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，其具有成本低廉、易于構(gòu)建和改造、導入抗原提呈細胞后可持續(xù)表達產(chǎn)生很強的免疫應答等顯著優(yōu)勢，自1990 年被偶然發(fā)現(xiàn)以來發(fā)展迅速，成為當前分子生物學和免疫學中新的研究熱點[1]。但核酸疫苗的免疫原性低下、誘發(fā)的免疫效果不佳，一直制約著其臨床應用[2]。因此，核酸疫苗研究領(lǐng)域的一個關(guān)鍵問題是如何提高核酸疫苗的免疫原性及其誘發(fā)的免疫反應效果。研究者們使用各種方式以提高核酸疫苗對疾病的免疫保護能力，比如改變接種部位，使用脂多糖、分支桿菌等佐劑，結(jié)合電傳轉(zhuǎn)染技術(shù)等[3]，但增效作用都有限。鑒于抗原提呈細胞在核酸疫苗免疫應答過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，因而提高核酸疫苗活性的根本途徑在于高效、特異地將核酸疫苗導入抗原提呈細胞，并使它得到高效表達[4]。這個過程中運載核酸的載體非常關(guān)鍵，制備合適的DNA 導入載體成了研究者試圖提高核酸疫苗活性的重要策略。

近年來，菌蛻（bacterial ghosts，BG）被認為是極具潛力的核酸疫苗載體[4]。菌蛻是將細菌細胞壁裂解、去除細胞質(zhì)內(nèi)容物之后形成的細菌空殼。菌蛻保留了較為完整的細胞壁結(jié)構(gòu)和免疫原性，因而其表面結(jié)構(gòu)可以有效地與抗原提呈細胞相互作用，誘發(fā)強烈的免疫反應。同時，菌蛻可以裝載核酸疫苗，將其導入抗原提呈細胞中。當裝載核酸疫苗的菌蛻進入體內(nèi)時，宿主的抗原提呈細胞就會主動識別菌蛻，從而提高菌蛻裝載的核酸疫苗在抗原提呈細胞中的表達水平，進而增加抗原提呈及免疫應答水平。菌蛻的發(fā)現(xiàn)和運用，為研究核酸疫苗載體提供了一個全新的技術(shù)平臺[5]。

在以往的研究中，我們初步建立了菌蛻的制備及裝載核酸疫苗的方法，發(fā)現(xiàn)菌蛻確有靶向運載核酸疫苗的作用。但菌蛻裝載DNA 的效率不穩(wěn)定，且裝載質(zhì)粒DNA 后的菌蛻轉(zhuǎn)染抗原提呈細胞的效率也有待提高[6]。在本實驗中，我們以大腸桿菌DH5α制備菌蛻，在文獻報道及前期工作基礎上，優(yōu)化菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的條件，以獲得更高且更穩(wěn)定的裝載效果。鑒于破碎大腸桿菌后的細胞膜（即膜囊）能影響裝載效率，其濃度過高或過低都會導致裝載效率低下，我們摸索并優(yōu)化了菌蛻、質(zhì)粒和膜囊三者的最佳濃度比例。檢測裝載效率后，使用裝載質(zhì)粒DNA的菌蛻轉(zhuǎn)染抗原提呈細胞RAW264.7（巨噬細胞系）和DC2.4（樹突狀細胞系），優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，進一步分析菌蛻作為DNA 疫苗載體裝載質(zhì)粒DNA 并將其導入抗原提呈細胞的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW264.7 巨噬細胞株和DC2.4 樹突狀細胞為本室保存；大腸桿菌DH5α購于全式金公司；pHH43質(zhì)粒為德國Rainer Hass 教授惠贈；質(zhì)粒pDSred-N1購于BD Clontech 公司；pVAXI-mIi-TM 為本室構(gòu)建；胎牛血清、胰酶、DMEM 培養(yǎng)基和1640 培養(yǎng)基購于Gibco 公司；PI 購于Sigma 公司；HEPES 購于Amresco 公司；Mito Tracker 購于Invitrogen 公司；氯霉素、青霉素、鏈霉素購于華北制藥有限公司；質(zhì)粒大量抽提試劑盒購于威格拉斯公司；DNA marker DL2000購于TaKaRa公司。

1.2 菌蛻的制備

轉(zhuǎn)化pHH43 質(zhì)粒至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在氯霉素抗性LB 固體培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)過夜，挑出單克隆菌落轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，恒溫搖床過夜培養(yǎng)，隨后以1∶100 擴大培養(yǎng)，待D600nm為0.5 時于42℃誘導，當D600nm值降到0.3 以下時離心收集菌體，加入50 mL 無菌水重懸，并加入200 U/μL 青霉素、鏈霉素各100μL，4℃靜置過夜，取上清離心，沉淀懸浮，4℃靜置過夜，小心取出上清，離心，棄除上清，用無菌水重懸沉淀，此時溶液均勻，無絮狀不溶物，再次離心，收集的沉淀即為菌蛻，用無菌PBS重懸，混勻，測定菌蛻濃度。

1.3 膜囊的制備

以1∶1000 將大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)入LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再以1∶100 將大腸桿菌轉(zhuǎn)入LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，棄上清，沉淀稱重，用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0，含20%蔗糖）重懸（每克菌體加入4 mL），每克菌體加入600μg 溶菌酶，依次加入0.1 mol/L EDTA、0.5 mol/L MgCl2，離心收集菌體，沉淀重懸于冰冷的10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，超聲波破碎，離心收集上清，40 000 r/min 離心1 h，沉淀重懸于2 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中。

1.4 菌蛻裝載質(zhì)粒

參照威格拉斯大提質(zhì)粒試劑盒說明書提取質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM，測定DNA 濃度。取質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi 質(zhì)粒各1 mg，加入400μL 冰冷的無水乙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀溶于50μL HBS 中，測定質(zhì)粒DNA 的濃度；取菌蛻，6000 r/min 離心10 min，棄上清，用冰冷的CaCl2反復洗滌菌蛻（6000 r/min 離心10 min），棄上清，向菌蛻中加入10μL HBS，混勻；按菌蛻140μg/質(zhì)粒200μg 的比例向菌蛻中加入質(zhì)粒，加入HBS 定容至20μL，輕輕混勻，28℃水浴1 h；取出膜囊，按200μg 質(zhì)粒/80μg 膜囊的比例加入，加入13μL 0.1 mol/L CaCl2，輕輕混勻后于37℃過夜。

取出-20℃凍存的Mito Tracker染料，融后混勻，取0.5μL 稀釋至500μL PBS 中，混勻，取出37℃孵育的裝載混合液，每管加入35μL 染料，37℃靜置15 min，2000 r/min 離心10 min，加入PBS 定容至500μL，加入細胞核熒光染色劑PI 2μg/mL，混勻，用流式細胞術(shù)測定裝載效率。

取制備的菌蛻和裝載質(zhì)粒pDSred-N1 的菌蛻，分別用掃描電鏡（HITACHI S-4500）和透射電鏡（Philps-EM 400T）觀察菌蛻的外膜結(jié)構(gòu)，以及菌蛻裝載質(zhì)粒前后的結(jié)構(gòu)變化。

1.5 抗原提呈細胞吞噬菌蛻

37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7和樹突狀細胞DC2.4；取菌蛻裝載的質(zhì)粒pDSred-N1 1 mg（菌蛻用Mito Tracker 染色），與2 mL 無血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻，分別與RAW264.7細胞和DC2.4 細胞孵育過夜，用PBS 洗滌1 次，激光掃描共聚焦顯微鏡（Bio-Rad Radiance2100）觀察抗原提呈細胞吞噬菌蛻的效果。按上述方法取1×106細胞，用流式細胞術(shù)測定抗原提呈細胞吞噬菌蛻的效率。

2 結(jié)果

2.1 菌蛻的制備

質(zhì)粒pHH43 為溫控型表達載體，可在42℃誘導表達φX174 噬菌體的裂解蛋白（E 蛋白），裂解革蘭陰性菌。結(jié)果表明，在誘導過程中D600nm值明顯下降并維持在0.3 以下，提示大腸桿菌得到了有效裂解。將裂解細菌洗滌、離心，獲得菌蛻。將大腸桿菌在堿裂解液中超聲波破碎，獲得裂解的大腸桿菌。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，與大腸桿菌及其裂解液相比，菌蛻內(nèi)DNA已隨著細胞內(nèi)容物被洗去（圖1）。

2.2 菌蛻裝載質(zhì)粒的效率

本研究采用的裝載方法是在本研究室前期工作基礎上加以改進。分別用PI 將質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM 染色，菌蛻用Mito Tracker 標記；將不同比例的質(zhì)粒DNA 與菌蛻混合孵育后，用膜囊將菌蛻封閉，以優(yōu)化裝載條件。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果（圖2）表明，當質(zhì)粒DNA、菌蛻、膜囊混合的比例為10∶7∶4 時裝載效率達到最高，2 種質(zhì)粒的裝載效率都達到了98%以上，其中片段較長的質(zhì)粒pVAXImIi-TM 的裝載效率幾乎為100%。以上結(jié)果說明菌蛻可以有效裝載質(zhì)粒DNA，且裝載效率不會受DNA片段大小的影響。

2.3 掃描電鏡和透射電鏡觀察菌蛻和裝載質(zhì)粒的菌蛻

為了檢測大腸桿菌是否得到了有效裂解，以及菌蛻是否能夠有效裝載質(zhì)粒DNA，我們將制備得到的菌蛻和裝載質(zhì)粒的菌蛻在掃描電鏡和透射電鏡下進行觀察。掃描電鏡結(jié)果顯示（圖3A），在菌蛻的兩端出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，提示大腸桿菌被成功地誘導裂解，在菌體兩端形成了非常明顯的裂解通道。透射電鏡的結(jié)構(gòu)顯示，制備的菌蛻內(nèi)部基本不著色，提示其DNA 等內(nèi)容物基本洗滌干凈（圖3B）；反之，裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻內(nèi)部有有較多的高密度物質(zhì)（黑色絮狀物）（圖3C），提示菌蛻裝載質(zhì)粒DNA的效率較高，可以作為很好的質(zhì)粒DNA載體。

2.4 抗原提呈細胞吞噬菌蛻的效率

為了檢測菌蛻是否能有效導入抗原提呈細胞，增強質(zhì)粒DNA 的提呈效率，我們用激光共聚焦顯微鏡檢測了裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻（Mito Tracker 標記）轉(zhuǎn)染抗原提呈細胞RAW264.7和DC2.4，發(fā)現(xiàn)幾乎所有RAW264.3 細胞內(nèi)都可以觀察到綠色熒光信號，提示Mito Tracker 標記的菌蛻被巨噬細胞吞噬到胞內(nèi)（圖4）。

圖1 大腸桿菌和菌蛻的DNA電泳圖

圖2 流式細胞術(shù)測定菌蛻裝載質(zhì)粒的效率

圖3 掃描電鏡和透射電鏡觀察裝載質(zhì)粒DNA前后的菌蛻

進一步用流式細胞術(shù)定量分析轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果見圖5，RAW264.7和DC2.4 細胞轉(zhuǎn)染菌蛻后，Mito Tracker 的綠色熒光強度明顯增強，將轉(zhuǎn)染前后的峰圖擬合，轉(zhuǎn)染后的峰明顯右移，且峰形較好，說明基本上所有細胞均有吞噬現(xiàn)象，效率幾乎高達100%，從而顯示出標記在菌蛻表面的綠色熒光。部分細胞內(nèi)的熒光強度較弱，提示其吞噬菌蛻的量較少。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，菌蛻能夠高效導入抗原提呈細胞，這對增加DNA 疫苗在抗原提呈細胞中的表達水平是非常有益的。

3 討論

φX174噬菌體的裂解基因E編碼一個含91個氨基酸殘基的膜蛋白，該蛋白能夠融合革蘭陰性菌的內(nèi)外膜，并在菌膜上形成一個直徑為40～200 nm 的特異性跨膜孔道。跨膜孔道的形成使得革蘭陰性菌內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變，細胞內(nèi)容物由裂解孔道排出，生成菌蛻。采用這種方法已成功地制備了大腸桿菌、霍亂弧菌和幽門螺桿菌等的細菌菌蛻[7-8]。在菌蛻制備過程中，細菌表面的抗原結(jié)構(gòu)沒有受到任何化學和物理作用的損傷，保留了活菌樣的完好形態(tài)結(jié)構(gòu)，如脂多糖、肽聚糖和包膜特異性受體等免疫刺激成分，因而能夠被巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原提呈細胞主動攝取，具有免疫系統(tǒng)靶向性質(zhì)[9]。故而裝載核酸的菌蛻能夠靶向性地將DNA 導入抗原提呈細胞，是良好的DNA 疫苗遞送載體。菌蛻可經(jīng)口服、皮下、肌肉注射等途徑使用，可操作性極強[10]。此外，作為細菌空殼，菌蛻沒有感染能力，具有安全性好，易于制備、保存等優(yōu)點，有望成為安全有效的核酸疫苗遞送載體，被廣泛開發(fā)用于各個領(lǐng)域，如腫瘤疫苗的設計和發(fā)展、靶標藥物和微酶反應等[11]。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察標記菌蛻被巨噬細胞RAW264.3吞噬

圖5 流式細胞術(shù)檢測抗原提呈細胞

高效地將質(zhì)粒DNA 裝載到菌蛻中，是菌蛻介導的核酸疫苗遞送能否成功的關(guān)鍵步驟。Pauker等發(fā)現(xiàn)每個菌蛻可以裝載6000 個質(zhì)粒DNA，容量很大，且裝載質(zhì)粒的菌蛻能靶向到小鼠巨噬細胞，表達率為60%[12]。但我們參照他們的方法裝載質(zhì)粒DNA 卻一直沒有成功。究其原因，Pauker 等直接將DNA 與菌蛻混合，以包被質(zhì)粒，但他們提供的實驗方法中缺少將裝載的DNA 封閉在菌蛻中的關(guān)鍵步驟，導致裝載在菌蛻中的DNA 在洗滌過程中丟失。在前期研究中，我們用大腸桿菌菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 之后，用大腸桿菌膜囊封閉菌蛻，成功地將質(zhì)粒DNA 裝載在菌蛻內(nèi)[13]，使用裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻轉(zhuǎn)染巨噬細胞Raw264.7，報告基因的表達效率可超過50%。但前期研究的裝載效率偏低，且不穩(wěn)定，原因可能是只對菌蛻和質(zhì)粒的濃度比例進行了探索，沒有優(yōu)化膜囊濃度。在本研究中，我們將大腸桿菌DH5α超聲波破碎后，離心收集破碎的細胞膜成分，即膜囊。我們發(fā)現(xiàn)膜囊能影響菌蛻裝載效率。膜囊濃度過低，裝載質(zhì)粒的菌蛻不能完全封閉；膜囊濃度過高，會影響菌蛻裝載質(zhì)粒效率。我們對菌蛻、質(zhì)粒和膜囊三者的最佳濃度進行了摸索和優(yōu)化，彌補了之前研究的空缺。結(jié)果表明，質(zhì)粒、菌蛻、膜囊三者的濃度比為10∶7∶4 時可達到最高裝載效率，效率穩(wěn)定維持在98%以上，多數(shù)情況可高達100%。

為了測定菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的效率，我們按照之前的方法將DNA 用PI 染色，菌蛻包被質(zhì)粒，隨后菌蛻用Mito Tracker 標記，用流式細胞術(shù)檢測裝載。然而在檢測過程中，我們發(fā)現(xiàn)PI 染色效果不好，同樣裝載方法的所獲得產(chǎn)物的檢測值波動較大。這可能是由于用PI 染色后，菌蛻包被過夜處理、Mito Tracker 標記菌蛻等步驟對熒光染料PI 產(chǎn)生了不利影響。于是我們嘗試菌蛻包被質(zhì)粒后，用Mito Tracker 標記菌蛻，再用PI 將質(zhì)粒染色，用流式細胞術(shù)檢測。這樣改進后，PI 濃度僅為2μg/mL 即可成功染色，而且染色效果比改進前要好。PI 對質(zhì)粒DNA 的染色效果非常穩(wěn)定，同種裝載條件所獲得的檢測結(jié)果也非常穩(wěn)定。

最后，我們優(yōu)化了菌蛻介導的轉(zhuǎn)染程序，發(fā)現(xiàn)裝載DNA 的菌蛻濃度對轉(zhuǎn)染效率的影響很大。當菌蛻濃度為0.5 mg/mL 時，可獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，幾乎所有細胞內(nèi)部均可看見綠色熒光，提示RAW264.7 及DC 等抗原提呈細胞能夠高效吞噬菌蛻。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示2種細胞對菌蛻的吞噬效率均為100%。

綜上所述，我們成功地制備了菌蛻，優(yōu)化了菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的條件，建立了穩(wěn)定的裝載方法及裝載效率的檢測方法，提高了菌蛻裝載DNA 的裝載效率，使菌蛻裝載幾乎達到100%。在轉(zhuǎn)染實驗中，幾乎在100%的抗原提呈細胞內(nèi)均可檢測到菌蛻，提示菌蛻確實是一種靶向有潛力的高效遞送載體，能高效進入巨噬細胞并使攜帶的質(zhì)粒DNA 獲得高水平表達。今后我們將通過動物實驗探討菌蛻提高DNA 疫苗免疫應答水平的可能性。我們相信，隨著對免疫科學進一步的探索，菌蛻高效運載核酸的潛力將進一步被挖掘，成為治療疾病的強有力工具。

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