李晶，苑方園，程速遠(yuǎn)，張慧，梁成罡

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650504

尿酸氧化酶（urate oxidase，UOX）是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，能將難以溶解的尿酸氧化為尿囊素、過氧化氫和二氧化碳[1-2]，尿囊素的溶解度是尿酸的5～10 倍，易于排出體外，從而緩解痛風(fēng)病人的痛苦。UOX 由4 個相同的亞基組成，每個亞基由302 個氨基酸殘基構(gòu)成，整個蛋白的相對分子質(zhì)量約為145 000～150 000，分子較大[3]。UOX 廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、鳥類、爬行類動物體內(nèi)，但在人類及某些靈長類動物（如狒狒和猿）的進化過程中，其第33和187 位的2 個氨基酸殘基發(fā)生了無義突變，導(dǎo)致編碼提前終止，使人類不能產(chǎn)生有生物活性的UOX[4-5]。因此，UOX 進入人體后，極易被免疫系統(tǒng)識別為外源蛋白，從而引發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)甚至引起過敏性休克。

聚乙二醇（PEG）化重組尿酸氧化酶（PEGrUOX）通過將水溶性大分子聚合物PEG 與rUOX 共價結(jié)合成新的修飾藥物，降低了其免疫原性，并延長了rUOX在體內(nèi)的半衰期[6-8]。2010年9月，Savient公司的PEG 化重組豬尿酸氧化酶（pegloticase）在美國上市銷售。臨床數(shù)據(jù)表明，PEG 化重組豬尿酸氧化酶每2 周注射1 次，在人體內(nèi)的半衰期為10.5～19.9 d[9-10]，而未修飾的rUOX 在體內(nèi)的半衰期僅為19 h；同時該藥可以消除已形成的痛風(fēng)石，從而達(dá)到根治石性痛風(fēng)的作用[11]。目前，國內(nèi)PEG-rUOX 已進入臨床前研究階段，各廠家的rUOX的一級序列均有所不同，其中一家企業(yè)的PEG-rUOX 正在申請臨床試驗。由于rUOX 本身分子較大，每個亞基上均有20多個PEG 修飾位點，因此修飾后的產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子大為增加。與原型蛋白相比，其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的巨大變化，為質(zhì)量控制尤其是修飾產(chǎn)物的蛋白含量測定帶來較大的難度。常規(guī)的蛋白質(zhì)含量測定方法如凱式定氮法靈敏度較低，操作繁瑣，無法將其應(yīng)用于常規(guī)檢測中；而一些基于生化反應(yīng)的蛋白含量測定方法如Lowry 法、考染法等，受PEG 的干擾較大，PEG 修飾蛋白往往在反應(yīng)中發(fā)生沉淀，PEG 修飾對照品的蛋白含量也因此難以準(zhǔn)確賦值。我們以原型蛋白rUOX 作為PEG-rUOX 含量測定的對照品，采用凝膠色譜法，通過詳細(xì)的方法學(xué)考察，建立了較為通用的蛋白質(zhì)含量測定方法，可同時對2種不同的PEG-rUOX進行準(zhǔn)確的含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料

2種rUOX 及其PEG-rUOX 原液分別由國內(nèi)J、M廠家提供；濃鹽酸、氯化鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自Amresco 公司；其他試劑非特殊說明均為分析純級。

pH 酸度計METTLER MP230K、電子天平Mettler Toledo xs205PV（瑞士Mettler 公司）；電子天平AND-HF400（日本AND 公司）；島津20AT 高效液相泵、島津SPD20A 檢測器、島津GIL20AC 自動進樣器、島津LTO10AS柱溫箱、Solustion 島津色譜工作站（日本島津貿(mào)易有限公司）；TSK Gel 5000PWxl凝膠色譜柱（日本東洋曹達(dá)TOSOH）；XW-80A 渦旋振蕩儀（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.2 紫外吸收波長掃描

將2 種PEG-rUOX 原液及rUOX 自制對照品用超純水稀釋至0.5 mg/mL 左右，置于紫外分光光度計中，700～200 nm掃描。

1.3 流動相和色譜條件

1.3.1 流動相的配制 稱取Tris 6.06 g，氯化鈉8.77 g，加超純水800 mL 溶解，用濃鹽酸調(diào)至pH9.0，定容至1000 mL，抽濾，脫氣備用。

1.3.2 色譜條件 用TSK Gel 5000PWxl 凝膠色譜柱，柱溫25℃，流速0.5 mL/min，檢測波長280 nm。

1.4 專屬性及系統(tǒng)適用性

分別將2 種rUOX 自制對照品和PEG-rUOX 原液用流動相稀釋至約1 mg/mL，等體積混合，各取10μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算rUOX和PEG-rUOX 的分離度。另取10μL 流動相注入液相色譜儀，作為空白對照。

1.5 線性

分別取2 種rUOX 自制對照品適量，用流動相稀釋至每1 mL 含rUOX 1.0 mg，作為對照品儲備液。精密量取該溶液200、160、120、80、40μL，分別置于EP 管中，加入流動相至終體積為200μL，搖勻，制成濃度為1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL 的系列對照品溶液。按上述色譜條件，各取10μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.6 定量限與檢測限

取1.5 項下的對照品儲備液，用流動相稀釋至0.2 mg/mL。取5μL 該溶液加入495μL 流動相，得到0.002 mg/mL 的rUOX 溶液，分別取100、50、40、30、20、15、10、7、5、3、1μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。記錄信噪比S/N 分別為10∶1（定量限）和3∶1（檢測限）時的進樣量。

1.7 精密度與穩(wěn)定性

取2 種濃度為0.6 mg/mL 的rUOX 對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5 次，進樣量10μL，記錄rUOX對照品峰面積及保留時間，計算RSD%。

取2 種濃度為0.6 mg/mL 的rUOX 對照品溶液，放置于4℃溫控進樣器中，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣10μL，記錄rUOX 的峰面積及保留時間，計算RSD%。

1.8 回收率

1.8.1 含量測定 將2 種PEG-rUOX 原液分別用流動相稀釋至0.4～0.8 mg/mL，進樣10μL，根據(jù)相應(yīng)rUOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其蛋白含量。

1.8.2 回收率考察 將2 種PEG-rUOX 原液稀釋至0.6 mg/mL，取100μL，分別加入0.6 mg/mL 的rUOX對照品70、100、130μL，制備成低、中、高3 個濃度的供試品溶液，按上述色譜條件進樣10μL，記錄色譜圖，根據(jù)相應(yīng)rUOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算加樣回收率。

1.9 重現(xiàn)性

2 種PEG-rUOX 注射液各取1 批，分別用流動相稀釋至0.6 mg/mL，平行制備6 份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定含量，計算RSD%（n=6）。

2 結(jié)果

2.1 紫外吸收波長

經(jīng)波長掃描，2 種PEG-rUOX 原液與rUOX 除214 nm的末端吸收外，在280 nm處存在最大吸收。

2.2 專屬性及系統(tǒng)適用性

在建立的色譜條件下，2 種rUOX 與2 種PEGrUOX 均能達(dá)到基線分離，2 個廠家的rUOX 與PEGrUOX 在色譜圖上的位置相似，典型色譜圖見圖1。rUOX 與PEG-rUOX 的分離度、二者的理論塔板數(shù)及拖尾因子均能滿足要求，見表1。

2.3 線性

分別以rUOX峰面積為縱坐標(biāo)、對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)進行直線回歸，結(jié)果表明在280 nm 下，rUOX 在200～1000μg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，見圖2、3。

2.4 定量限及檢測限

J 廠家rUOX 濃度為0.002 mg/mL，進樣10μL時S/N 為10∶1，進樣5μL 時S/N 為3∶1，即M 廠家rUOX的定量限為20 ng，檢測限為10 ng。

M 廠家rUOX 濃度為0.002 mg/mL，進樣15μL時S/N 為10∶1，進樣7μL 時S/N 為3∶1，即J 廠家rUOX的定量限為30 ng，檢測限為14 ng。

2.5 精密度與穩(wěn)定性

2 種rUOX 的5 次進樣峰面積的RSD%分別為0.06%和0.2%（n=5），保留時間RSD%均為0.02%（n=5），方法精密度良好。樣品12 h 內(nèi)峰面積RSD%為0.46%，表明rUOX在12 h內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。

2.6 回收率

2.6.1 含量測定 M 廠家PEG-rUOX 含量測定結(jié)果為0.65 mg/mL，乘以稀釋率即得PEG-rUOX 的原液濃度為1.95 mg/mL；J廠家PEG-rUOX含量測定結(jié)果為0.62 mg/mL，乘以稀釋率即得PEG-rUOX 原液濃度為6.2 mg/mL。

表1 專屬性及系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果

2.6.2 回收率考察 將PEG-rUOX 峰面積與rUOX峰面積之和帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得總的含量值，計算回收率：

中濃度回收率=（總的含量值-0.3）÷0.3×100%；

低濃度回收率=（總的含量值-0.353）÷0.247×100%；

高濃度回收率=（總的含量值-0.261）÷0.339×100%。

2 種rUOX 平均加樣回收率為98.33%～99.96%，表明該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于PEG-rUOX原液的準(zhǔn)確定量。結(jié)果見表2。

2.7 樣品測定及重現(xiàn)性

制備多份樣品平行測定，J廠家含量測定結(jié)果的RSD%為0.40%（n=6），M 廠家為0.48%（n=6）。結(jié)果表明，本方法的重現(xiàn)性良好。

3 討論

3.1 分離方式的選擇

一般來說，含量測定首先考慮分辨率較高的反相液相色譜法，但該方法對于PEG-rUOX 而言并沒有較大優(yōu)勢。由于PEG 本身為混合物，使得修飾產(chǎn)物在反相色譜上很難以一個對稱性很好的色譜峰洗脫出來，連接不同PEG 數(shù)量的修飾產(chǎn)物或修飾個數(shù)相同的位點異構(gòu)體往往以肩峰或分叉峰形式洗脫，給準(zhǔn)確積分造成較大困難。同時，原型蛋白rUOX本身為含有4 個相同亞基的分子較大的蛋白質(zhì)，每個亞基中又含有1 個游離的巰基，因此，在以有機相為流動相的反相色譜中難以得到對稱性良好、巰基不發(fā)生錯配的色譜峰?？紤]到方法的通用性和積分的準(zhǔn)確性，我們選擇了凝膠色譜法進行方法優(yōu)化。

圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖

圖2 M廠家rUOX標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 J廠家rUOX標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表2 280 nm波長下PEG-rUOX的回收率

3.2 流動相的選擇

本研究分別選用了超純水、50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）、50 mmol/L Tris-HCl 含150 mmol/L 氯化鈉共3 種流動相。用超純水做流動相時，主峰出峰時間很早，但PEG-rUOX和rUOX對照品的峰型均拖尾嚴(yán)重。以50 mmol/L Tris-HCl 作為流動相時，由于Tris-HCl 的緩沖能力，使體系穩(wěn)定性增強，rUOX 色譜峰峰型較好，但PEG-rUOX 色譜峰的拖尾卻較嚴(yán)重。分析原因，可能是流動相體系的離子強度不夠，使分子很大的PEG-rUOX 在色譜柱中與填料的吸附作用較明顯而造成拖尾。流動相中加入150 mmol/L 氯化鈉后離子強度大為提高，PEGrUOX 的峰型得到明顯改善。但由于PEG-rUOX 是不同PEG 修飾個數(shù)的混合物，分子有所不同，使得PEG-rUOX 的峰型較寬，而rUOX 的峰型較為尖銳。在此條件下，PEG-rUOX和rUOX 的分離度均大于1.5，可用于PEG-UOX的定量測定。

3.3 柱溫的選擇

我們分別選用了25℃和30℃柱溫。柱溫為30℃時，M 廠家的PEG-rUOX 主峰發(fā)生分叉，可能是由于溫度升高使PEG-rUOX 不同修飾產(chǎn)物之間的分離度變大，但又不能達(dá)到基線分離度，因此造成色譜峰分叉，不適合定量分析。25℃時，PEG-rUOX 為單一峰型，對稱性良好，可用于定量分析。

3.4 測定波長的選擇

2 種rUOX 的氨基酸一級序列有所不同，但每個亞基上可以發(fā)生PEG 修飾的位點均有20 多個。J廠家與M 廠家所使用的PEG 相對分子質(zhì)量均為5000，活化基團均為琥珀酰亞胺酯基，通過與rUOX上的游離氨基（N端的α氨基及Lys的ε氨基）發(fā)生反應(yīng)，生成酰胺鍵對rUOX進行共價修飾。因此，由于修飾后的分子在PEG 與rUOX 的連接位置處存在羰基等雙鍵，在214 nm 進行含量測定時PEG-rUOX 與rUOX的響應(yīng)因子必然不同。如果以rUOX 為對照品對PEG-rUOX 進行賦值，如果不采用相對響應(yīng)因子進行校正，則與真實值相比測定結(jié)果勢必偏大，從而造成回收率結(jié)果偏高。然而，如果在280 nm進行測定則情況完全不同。因為280 nm 為典型的共軛π鍵吸收，PEG 與rUOX 連接點以及PEG 本身可能的羰基并不對大π鍵有所貢獻。此時再以rUOX 為對照品對PEG-rUOX 中的蛋白含量進行測定，則2 個物質(zhì)的響應(yīng)因子應(yīng)基本一致，回收率結(jié)果也證實了這一點。

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