施鳴銘，楊祖立，朱曉芳，鄭雅娟，張世馥

(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310018)

研究論文

P38-2G4蛋白在紅系細(xì)胞分化過程中的動態(tài)表達(dá)分析

施鳴銘，楊祖立，朱曉芳，鄭雅娟，張世馥*

(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310018)

目的分析小鼠P38-2G4蛋白在紅系細(xì)胞分化中的表達(dá)及功能，初步研究該蛋白是否參與紅系分化過程。方法制備E10.5～E16.5胎肝細(xì)胞、FVA細(xì)胞及誘導(dǎo)劑丁酸鈉和六亞甲基二乙酰胺誘導(dǎo)不同時間的小鼠紅白血病細(xì)胞MEL，用Western blot檢測P38-2G4蛋白在上述3種細(xì)胞中的表達(dá)，同時以聯(lián)苯胺染色法檢測細(xì)胞分化的標(biāo)志蛋白血紅蛋白的表達(dá)。結(jié)果在不同分化期的胎肝細(xì)胞中，P38-2G4蛋白的表達(dá)先升高后降低；在FVA細(xì)胞分化過程中，P38-2G4表達(dá)量同樣先增加后減少；而在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化過程中，P38-2G4表達(dá)量呈下降趨勢。結(jié)論P(yáng)38-2G4蛋白在不同紅系分化組織中的差異性表達(dá)提示該蛋白參與了小鼠紅系細(xì)胞的分化過程。

P38-2G4；胎肝；FVA細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；紅系分化

小鼠P38-2G4蛋白屬增殖相關(guān)蛋白家族(proliferation-associated protein 2G4, PA2G4)，是細(xì)胞周期特異性調(diào)節(jié)的DNA結(jié)合蛋白[1]，目前對其研究較少。肝臟是胚胎時期主要的造血器官，小鼠E12～E15[2]和人胚胎6周至4月是胎肝造血活躍期。小鼠尾靜脈注射小鼠致貧血病毒(anemia-inducing strain of Friend virus, FVA)后，其脾臟中紅系細(xì)胞發(fā)育被同步阻滯在原紅細(xì)胞時期，稱為FVA細(xì)胞[3]。該細(xì)胞在體外促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)存在培養(yǎng)下可進(jìn)入終末分化。小鼠紅白血病細(xì)胞(mouse erythroleukemia, MEL)在多種誘導(dǎo)劑作用下可發(fā)生惡性逆轉(zhuǎn)并向正常方向分化。

本研究前期發(fā)現(xiàn)P38-2G4蛋白在胎肝紅系分化過程中存在差異性表達(dá)，推測其參與小鼠紅系分化過程。本實(shí)驗(yàn)擬通過胎肝細(xì)胞、FVA細(xì)胞及誘導(dǎo)分化細(xì)胞中P38-2G4蛋白的表達(dá)，探索其是否參與紅系細(xì)胞分化過程，為進(jìn)一步研究P38-2G4在紅系分化過程中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物和細(xì)胞

MEL、K562和HL-60細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。小鼠致貧血病毒FVA(ATCC)。清潔級，6～8周齡，體質(zhì)量25 g左右的ICR(Institute of Cancer Research)小鼠和20 g左右的BALB/C小鼠[杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK(浙2011-0048)]。

1.2 試劑

六甲基雙乙酰胺(HMBA，Sigma公司)，丁酸鈉(SB，Sigma公司)，IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，促紅細(xì)胞生成素(EPO，R&D公司)，α-硫代甘油(Sigma公司)，L-谷氨酰胺(Sigma公司)，牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)，聯(lián)苯胺(中國遠(yuǎn)航試劑公司)，兔抗小鼠P38-2G4抗體(Abcam公司，ab33613)，羊抗兔IgG單克隆抗體(Earthox公司)，Western bright ECL底物發(fā)光試劑盒(Advansta公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞樣品的制備：MEL細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，第2～3天傳代1次，取對數(shù)增殖期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞，1 000r/min離心10 min，棄上清，PBS洗3次，1×107細(xì)胞加入1 mL細(xì)胞裂解液，置冰上30 min。4 ℃，12 000r/min，離心30 min，取上清備用。HL-60，K562細(xì)胞同樣處理。

1.3.2 小鼠組織樣品的制備：ICR小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠骨髓、腦、胃、小腸、腎、肺、脾、肝和心臟等組織，用D-Hank’s緩沖液沖洗3次，剪碎后放入微量勻漿器中，按0.1 kg/L加入細(xì)胞裂解液，置冰上30 min，4 ℃，12 000r/min，離心45 min，收集上清，備用。

1.3.3 胎肝樣品的制備：懷孕E10.5～E16.5 ICR小鼠頸椎脫臼處死，分離胎肝組織于D-Hank’s緩沖液中。制成單細(xì)胞懸液，D-Hank’s緩沖液洗2次，室溫25 ℃，1 000r/min，離心10 min，重懸于D-Hank’s緩沖液中。

1.3.4 FVA細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：給BALB/C小鼠尾靜脈注射病毒10～14 d左右，頸椎脫臼處死，取脾臟制成單細(xì)胞懸液，D-Hank’s緩沖液洗2次，室溫，1 000r/min，離心10 min，重懸于含30% 胎牛血清，0.1% 牛血清白蛋白，10-4mol/L α-硫代甘油，2 mmol/L谷氨酰胺的IMDM培養(yǎng)基中。錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)，F(xiàn)VA細(xì)胞按1×109/L接種于培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)組加入200 IU/L EPO，37 ℃，5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3.5 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：取對數(shù)增殖期MEL細(xì)胞以3×107/L濃度接種于細(xì)胞瓶，加入丁酸鈉(1.25 mmol/L)或六甲基雙乙酰胺(3 mmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞。同時設(shè)置不加藥的對照組，分別培養(yǎng)1～5 d。

1.3.6 聯(lián)苯胺染色檢測血紅蛋白：分別收集培養(yǎng)1～5 d的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞，室溫，1 000r/min，離心3 min；棄上清，0.85 %氯化鈉溶液洗1次，加入預(yù)混的聯(lián)苯胺染液(30% H2O2:0.04%聯(lián)苯胺染液1∶40, v∶v)，滴片鏡檢、拍照。

1.3.7 Western blot檢測P38-2G4表達(dá)：收集各組樣品，提取細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定。取適量總蛋白，用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入抗小鼠P38-2G4多克隆抗體(1∶20 000)和抗小鼠β-actin(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液TBST洗膜后加入羊抗兔(1∶20 000)二抗(含辣根過氧化物酶標(biāo)記)，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜后化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)。對條帶進(jìn)行灰度掃描，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值比值計(jì)算不同樣品的目的蛋白表達(dá)量差異。

2 結(jié)果

2.1 P38-2G4蛋白的小鼠組織表達(dá)譜

取小鼠的腦、胃、小腸、腎、肺、脾、肝和心等組織，檢測P38-2G4在小鼠組織中的表達(dá)(圖1)。

圖1 P38-2G4蛋白在小鼠組織表達(dá)Fig 1 P38-2G4 expresses in different tissues of mouse

2.2P38-2G4蛋白在不同白血病細(xì)胞及正常造血細(xì)胞中的表達(dá)

收集K562、MEL、HL-60腫瘤細(xì)胞樣品，小鼠骨髓為正常造血細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blot(圖2)。K562、HL-60、MEL細(xì)胞中P38-2G4的表達(dá)量分別是骨髓細(xì)胞的3.39、2.65和2.33倍。

圖2 P38-2G4蛋白在白血病細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 P38-2G4 expresses in leukemia cells and marrow cells

2.3不同發(fā)育期的胎肝中P38-2G4蛋白的差異性表達(dá)

A.the benzidine staining of fetal liver cells in different days; B.the expression of P38-2G4 from E10.5 to E16.5; 1.E10.5 fetal liver; 2.E13.5 fetal liver; 3.E16.5 fetal liver, it shows karyopyknosis and enucleation(×600)圖3 不同發(fā)育期胎肝細(xì)胞的聯(lián)苯胺染色與Westernblot檢測P38-2G4蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 3 The benzidine staining and Western blot result of fetal liver cells at different development stages

對小鼠E10.5，E13.5，E14.5胎肝進(jìn)行聯(lián)苯胺染色，胎肝中的紅系祖細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小，細(xì)胞核固縮，排核等分化特征(圖3A)。取E10.5～E16.5的胎肝總蛋白進(jìn)行Western blot，檢測P38-2G4蛋白在不同發(fā)育期的胎肝中的表達(dá)情況(圖3B)。

2.4FVA細(xì)胞紅系分化時P38-2G4蛋白的表達(dá)差異

在200 IU/L EPO條件下培養(yǎng)FVA細(xì)胞，出現(xiàn)紅系終末分化特征，如細(xì)胞體積減小，細(xì)胞核減小，核固縮等(圖4A)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)P38-2G4蛋白在FVA細(xì)胞中的表達(dá)也存在差異性(圖4B)。

A.the benzidine staining of FVA cell differentiating induced by EPO; B.the expression of P38-2G4 during differentiation; 1.the 2nd hour of FVA cells induced by EPO, it shows karyopyknosis; 2.the 12th hour of FVA cells induced by EPO; 3.the 24th hour of FVA cells induced by EPO, it shows enucleation; 4.the 36th hour of FVA cells induced by EPO(×600)圖4 EPO誘導(dǎo)FVA細(xì)胞分化過程的聯(lián)苯胺染色和Western blot檢測P38-2G4蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 4 The benzidine staining and Western blot result of FVA cells induced by EPO

2.5誘導(dǎo)分化細(xì)胞中P38-2G4蛋白的差異性表達(dá)

利用丁酸鈉(sodium butyrate，SB)和六亞甲基二乙酰胺(N,N′-Hexamethylenebisacetamide，HMBA)誘導(dǎo)MEL細(xì)胞向紅系方向分化。SB可有效誘導(dǎo)MEL細(xì)胞向紅系方向發(fā)生定向分化，合成血紅蛋白，且核質(zhì)比減小(圖5A)。而在SB誘導(dǎo)MEL分化過程中，P38-2G4蛋白表達(dá)量呈逐漸遞減趨勢，120 h細(xì)胞P38-2G4表達(dá)量為0 h細(xì)胞的0.41倍(圖5B)。同樣， 用HMBA誘導(dǎo)MEL向紅系方向分化，Western blot檢測分化過程中P38-2G4的表達(dá)，結(jié)果也呈逐漸遞減趨勢(圖5C)。

A.the benzidine staining of MEL induced by SB; B.the expression of P38-2G4 during differentiation induced by SB; C.the expression of P38-2G4 during differentiation induced by HMBA; 1.the 72th hour of MEL; 2.the 96th hour of MEL; 3.the 72th hour of MEL induced by SB; 4.the 96th hour of MEL induced by SB(×200)

圖5誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MEL分化過程的聯(lián)苯胺染色和Westernblot檢測P38-2G4蛋白表達(dá)結(jié)果
Fig5ThebenzidinestainingandWesternblotresultofMELinducedbyinducer

3 討論

P38-2G4是一種DNA結(jié)合蛋白，屬增殖相關(guān)蛋白家族，目前對其功能尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)前期利用雙向凝膠電泳-質(zhì)譜分析胎肝紅系分化過程時發(fā)現(xiàn)P38-2G4蛋白存在差異性表達(dá)，由此推測該蛋白可能參與紅系分化過程。

結(jié)果顯示，P38-2G4蛋白在小鼠腦、胃、小腸、腎、肺、肝和心臟等組織中差異性表達(dá)，且在肝組織中表達(dá)量最高，提示該蛋白可能與造血功能相關(guān)；而在K562、HL-60、MEL 3種白血病細(xì)胞中，P38-2G4蛋白表達(dá)量高于骨髓細(xì)胞2～3倍，這表明P38-2G4在正常組織和腫瘤細(xì)胞中具有不同功能，并且與細(xì)胞的癌變相關(guān)。

胎肝細(xì)胞的聯(lián)苯胺染色及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，E10.5細(xì)胞已有血紅蛋白生成，細(xì)胞逐漸發(fā)生核固縮，并出現(xiàn)排核現(xiàn)象。Western blot結(jié)果顯示，P38-2G4蛋白從E10.5開始增加，E14.5達(dá)到E10.5的2.28倍，至E15.5開始下降(圖3B)。小鼠胎肝E12到E15為造血活躍期[2]，而P38-2G4蛋白的高表達(dá)正處于該時期，因此說明P38-2G4參與胎肝細(xì)胞的紅系分化過程。

FVA細(xì)胞聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示，在EPO存在條件下，F(xiàn)VA細(xì)胞向紅系方向分化，開始表達(dá)血紅蛋白，細(xì)胞核發(fā)生固縮、偏位。Western blot結(jié)果顯示，P38-2G4蛋白在2 h(原幼紅細(xì)胞)和12 h(早幼紅細(xì)胞)的表達(dá)量是0 h的1.21倍和1.11倍，隨后開始下降(圖4B)，這種差異性表達(dá)說明P38-2G4參與了FVA細(xì)胞的紅系分化過程。

SB作為一種去乙?；敢种苿軌蛱岣呓M蛋白乙?；剑T導(dǎo)MEL細(xì)胞向紅系方向分化。HMBA通過使細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化[4]。本文利用兩種誘導(dǎo)劑分別誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化，結(jié)果顯示兩種藥物誘導(dǎo)過程中，P38-2G4蛋白的表達(dá)量均被下調(diào)，且SB誘導(dǎo)過程中下調(diào)趨勢更明顯(圖5B,C)。這表明，P38-2G4蛋白確實(shí)參與了紅系分化過程。

據(jù)報道，Ebp1是一種人類增殖相關(guān)蛋白，與小鼠P38-2G4蛋白同源，兩者結(jié)構(gòu)相似，僅存在4個氨基酸殘基差異。Ebp1具有p42和p48兩種亞型，有不同的組織和功能特異性[5]，可通過促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖參與多種細(xì)胞的分化過程[6- 9]。因此推測，P38-2G4蛋白可能同樣通過增殖參與紅系細(xì)胞的分化。

綜上所述，P38-2G4蛋白在正常組織和癌變細(xì)胞中具有不同的功能，且參與多種紅系分化過程，但具體機(jī)制任有待深入研究。

[1] Nakagawa Y, Watanabe S, Akiyama K,etal. Cdna cloning, sequence analysis and expression of a mouse 44-kda nuclear protein copurified with DNA repair factors for acid-depurinated DNA[J]. Acta Medi Okayama, 1997, 51: 195- 206.

[2] Morrison S J, Hemmati H D, Wandycz A M,etal. The purification and characterization of fetal liver hematopoietic stem cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, 92: 10302- 10306.

[3] Koury M, Sawyer S, Bondurant M. Splenic erythroblasts in anemia‐inducing friend disease: A source of cells for studies of erythropoietin‐mediated differentiation[J]. J Cell Physiol, 1984, 121: 526- 532.

[4] 王欽紅, 范華驊, 陳勤奮等. 六亞甲基二乙酰胺體外誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化的機(jī)制[J]. 復(fù)旦學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2004, 1- 4.

[5] Squatrito M, Mancino M, Donzelli M,etal. Ebp1 is a nucleolar growth-regulating protein that is part of pre-ribosomal ribonucleoprotein complexes[J]. Oncogene, 2004, 23: 4454- 4465.

[6] Lessor T J, Yoo J Y, Xia X,etal. Ectopic expression of the erbb-3 binding protein ebp1 inhibits growth and induces differentiation of human breast cancer cell lines[J]. J Cell Physiol, 2000, 183: 321- 329.

[7] Ishimaru D, Ramalingam S, Sengupta T K,etal. Regulation of bcl-2 expression by hur in hl60 leukemia cells and a431 carcinoma cells[J]. Mol Cancer Res: MCR, 2009, 7: 1354- 1366.

[8] Kim C K, Nguyen T L, Joo K M,etal. Negative regulation of p53 by the long isoform of erbb3 binding protein ebp1 in brain tumors[J]. Cancer Res, 2010, 70: 9730- 9741.

[9] Oh S M, Liu Z, Okada M,etal. Ebp1 sumoylation, regulated by tls/fus e3 ligase, is required for its anti-proliferative activity[J]. Oncogene, 2010, 29: 1017- 1030.

Analysis of dynamic expression of P38-2G4 during erythroid cells differentiation

SHI Ming-ming, YANG Zu-li, ZHU Xiao-fang, ZHENG Ya-juan, ZHANG Shi-fu*

(Lab of Proteomics and Molecular Enzymology, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

ObjectiveAnalysis of the expression and function of mouse P38-2G4 protein in the differentiation of erythroid cells, and to find whethere P38-2G4 is involved in the differentiation of erythroid.MethodsThe expressions of P38-2G4 in fetal liver from E10.5 to E16.5, FVA cells and MEL cells induced by SB and HMBA were detected by Western bolt. The hemoglobin as a marker protein of erythroid cell differentiation was detected by benzidine staining.ResultsThe expression of P38-2G4 in fetal liver cells of different differentiating stages increased at first and then decreased; the expression of P38-2G4 during FVA cells differentiating had a same trend; but decreased during inducing.ConclusionsDifferential expression of P38-2G4 in different erythroid differentiation shows that P38-2G4 is involved in mouse erythroid differentiation.

：P38-2G4; Fetal liver; FVA cell; inducing differentiation; erythroid differentiation

2013- 01- 15

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)：cklzhan@163.com

1001-6325(2014)09-1245-05

Q 291

A