鄧海燕，曾俊義，魏云峰,，王夢(mèng)洪,，鄭澤琪,，張 婉，文 通

(南昌大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科； 2.江西省高血壓病研究所， 江西 南昌 330006)

研究論文

microRNA-1誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化過程中Notch信號(hào)分子的表達(dá)變化

鄧海燕1，曾俊義2*，魏云峰1,2，王夢(mèng)洪1,2，鄭澤琪1,2，張 婉2，文 通1

(南昌大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科； 2.江西省高血壓病研究所， 江西 南昌 330006)

目的探討微小RNA-1對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的影響及分化過程中Notch信號(hào)分子的表達(dá)變化。方法全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠MSCs并進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)鑒定，miR-1慢病毒載體感染大鼠MSCs(MSCsmiR-1)按培養(yǎng)時(shí)間將細(xì)胞分成4組：對(duì)照組、培養(yǎng)4、6和15 d組；光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，qPCR檢測(cè)miR-1及心肌細(xì)胞特異性基因GATA-4、cTnI、α-actin表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)cTnI表達(dá)，Western blot檢測(cè)α-actin表達(dá)；qPCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果原代大鼠MSCs呈長(zhǎng)梭形、漩渦狀生長(zhǎng)，98%以上細(xì)胞表達(dá)CD44和CD29，不足1%的細(xì)胞表達(dá)CD45。MSCsmiR-1中miR-1表達(dá)水平持續(xù)上升，同時(shí)伴隨心肌特異性基因GATA-4、cTnI和α-actin的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，感染4 d后可見cTnI在部分MSCsmiR-1中表達(dá)，同時(shí)可檢測(cè)到α-actin在MSCsmiR-1中表達(dá)；MSCsmiR-1向心肌樣細(xì)胞分化過程中，Notch信號(hào)分子Jagged1、Notch1、Notch3和Hey2表達(dá)水平逐漸下調(diào)，于15 d時(shí)下調(diào)幅度最大。結(jié)論傳導(dǎo)miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌樣細(xì)胞的分化；且分化過程中伴隨著Notch信號(hào)分子Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2表達(dá)水平下調(diào)。

miR-1；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌樣細(xì)胞；Notch

微小RNA(microRNAs,miRNAs)作為生命過程中一類重要的調(diào)控因子成為近年來的一大研究熱點(diǎn)。研究表明， miRNAs在一系列生物學(xué)行為比如干細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分化中起著非常重要的作用[1]。在眾多miRNAs中存在一類肌相關(guān)miRNAs，包括miR-1、miR-133、miR-206和miR-499等，其中以肌特異性miR-1的生物學(xué)作用尤為引人關(guān)注[2- 3]。目前認(rèn)為，miR-1主要存在于脊椎動(dòng)物的心臟組織中，在機(jī)體的心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞的分化成熟過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。因此，本研究通過miR-1慢病毒載體感染大鼠(mesenchymel stem cells,MSCs)，探討miR-1對(duì)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的影響及分化過程中notch信號(hào)分子的表達(dá)變化，以期闡明MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

4周齡清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量100～150 g，雌雄不限[江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào): SCXK(贛) 200520001]。α-MEM培養(yǎng)基和EDTA胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，倉鼠抗CD29單克隆抗體、小鼠抗CD44 單克隆抗體和小鼠抗CD45單克隆抗體(eBioscience公司)，miR-1重組慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR檢測(cè)試劑盒和miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(GeneCopoeia公司)，兔抗心肌肌鈣蛋白I多克隆抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗心肌肌動(dòng)蛋白α(武漢博士德公司)，小鼠抗β-actin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。miR-1及U6引物來自GeneCopoeia公司(RmiRQP1188, RmiRQP9003)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs分離、擴(kuò)增培養(yǎng)及鑒定：頸椎脫臼法處死大鼠,無菌條件下取出股骨和脛骨，剪除兩端干骺端，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,制成細(xì)胞懸液，以1×109/L接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中, 放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后可見少量貼壁細(xì)胞，48 h后第1次換液去除非貼壁細(xì)胞,此后每3天換液1次，待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，0.25% EDTA胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)至第3代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前取適量第3代MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，選取細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44和CD45作為檢測(cè)指標(biāo)，以確定細(xì)胞純度。

1.2.2 重組慢病毒載體感染大鼠MSCs及實(shí)驗(yàn)分組：預(yù)先構(gòu)建miR-1重組慢病毒載體，感染前1天將細(xì)胞以4×104/孔接種到12孔板中，并加入常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞的匯合率約為30%時(shí)按感染復(fù)數(shù)(MOI)50進(jìn)行感染，同時(shí)加入終濃度為8 μg/mL的polybrene[5]，放回培養(yǎng)箱孵育。24 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按培養(yǎng)時(shí)間將細(xì)胞分成對(duì)照組、培養(yǎng)4、6和15 d組。倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，評(píng)價(jià)慢病毒感染效率。提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)純度及濃度測(cè)定后行qPCR檢測(cè)miR-1，總RNA提取、cDNA合成及qPCR均按試劑說明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)采集由ABI7500完成。miR-1的檢測(cè)以U6作內(nèi)參，以2-△△Ct比較miR-1表達(dá)水平。

1.2.3 檢測(cè)心肌特異性基因的表達(dá)：取各組細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取、cDNA合成及qPCR反應(yīng)，分別按試劑說明書進(jìn)行。GATA-4：上游引物5′- CTGTGCCA ACTGCCAGACTA -3′，下游引物5′-AGATTCTTGGG CTTCCGTTT-3′，165 bp；α-actin：上游引物5′-AGCC ATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物5′-CTCTCAGC TGTGGTGGTGAA-3′，228 bp；cTnI：上游引物5′-CCT GCGTGGCAAGTTTAA-3′，下游引物5′-TTCCTTCTC AATGTCCTCCT-3′，94 bp；GAPDH：上游引物5′-CTC ATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物5′-TTCAGC TCTGGGATGACCTT-3′，155 bp。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)cTnI的表達(dá)：收集各組細(xì)胞爬片行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。棄去培養(yǎng)液, PBS沖洗, 4%多聚甲醛4 ℃固定20 min, 1%牛血清白蛋白(BSA)室溫30 min封閉非特異性抗原,1∶100稀釋的兔抗大鼠cTnI多克隆抗體于4 ℃孵育過夜,1∶200稀釋的TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h。封片后倒置熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)中用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.5 Western blot檢測(cè)α-actin的表達(dá)：分別收集各組細(xì)胞,提取總蛋白并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg處理的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)條件下以恒流將蛋白樣品從膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h, 加入適當(dāng)稀釋的一抗(α-actin濃度為1∶500，β-actin濃度為1∶1 000)，4 ℃過夜；根據(jù)一抗來源選擇辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，按相應(yīng)比例稀釋后室溫下孵育1 h。TBST洗膜后加入發(fā)光液顯影，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(LAS 4000)進(jìn)行圖像采集及目標(biāo)條帶分析。

1.2.6 Real time qPCR檢測(cè)Notch信號(hào)分子表達(dá)變化：分別取各組細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取、cDNA合成及qPCR反應(yīng)，分別按試劑說明書進(jìn)行。Notch信號(hào)通路相關(guān)基因引物見(表1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSCs分離培養(yǎng)與鑒定

MSCs接種24 h后少量開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形或多角形。48 h后首次換液去除未貼壁細(xì)胞，3～4 d后可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起，梭形細(xì)胞為主(圖1A)。5 d時(shí)細(xì)胞集落生長(zhǎng)范圍擴(kuò)大，匯合80%～90%，經(jīng)胰蛋白酶消化傳代后均勻鋪于瓶底，呈漩渦狀同向排列(圖1B)。第3代大鼠MSCs均一表達(dá)CD44和CD29，陽性率分別為98.03%，99.00%，而CD45呈陰性表達(dá)，陽性率僅為0.02%，證實(shí)培養(yǎng)所獲細(xì)胞為MSCs，且純度較高(圖2)。

表1 Notch信號(hào)通路相關(guān)基因引物序列

A .primary rat MSCs(×100);B.the third passage of rat MSCs(×100)圖1 大鼠MSCsFig 1 Micrographs of rat MSCs

2.2重組慢病毒載體感染大鼠MSCs效率及miR-1表達(dá)檢測(cè)

慢病毒感染大鼠MSCs第2天即可觀察到部分細(xì)胞表達(dá)GFP，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，隨培養(yǎng)時(shí)間推移，GFP陽性細(xì)胞逐漸增多，GFP表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至4 d時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)基本達(dá)到穩(wěn)定，其后持續(xù)高表達(dá)，感染效率達(dá)90%以上。到15 d時(shí)仍可見綠色熒光表達(dá)，部分細(xì)胞形態(tài)呈多角、短梭形變化(圖3)。miR-1表達(dá)水平隨時(shí)間逐漸增高，到15 d時(shí)MSCsmiR-1中miR-1表達(dá)量達(dá)到最高(表2)。

2.3 心肌特異性基因的表達(dá)變化

心肌特異性蛋白cTnI和α-actin只在誘導(dǎo)后的細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)水平逐漸上升，15 d時(shí)達(dá)到高峰；轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA-4在分化過程中的第4天表達(dá)水平稍下降，以后逐漸上升，一直持續(xù)到15 d(表3)。

表2 MSCsmiR-1 中miR-1表達(dá)變化Table 2 Expression of miR-1 in MSCsmiR-1

*P<0.01 compared with day 4.

More than 98% of the MSCs population expressed CD44 and CD29,less than 1% cells were CD45 positive圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)大鼠MSCs表面標(biāo)志物Fig 2 Identification of MSCs phenotype by flow cytometry

A.control group;B.4-day group;C.6-day group;D.15-day group圖3 MSCsmiR-1中GFP的表達(dá)Fig 3 GFP expression of MSCsmiR-1(×100)

2.4 免疫熒光檢測(cè)cTnI的表達(dá)

感染后的MSCsmiR-1細(xì)胞體積較前變長(zhǎng)和寬大，形成類似肌管樣的形態(tài)特點(diǎn)。MSCsmiR-1于感染后第

表3 MSCsmiR-1心肌特異性基因的表達(dá)變化

*P<0.05，**P<0.01compared with control；△P<0.05，△△P<0.01 compared with day 4.4天開始少量表達(dá)cTnI，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，陽性率逐漸增加(圖4)。

2.5 Western blot檢測(cè)α-actin的表達(dá)

感染前大鼠MSCs不表達(dá)α-actin。感染4 d時(shí)α-actin蛋白呈弱表達(dá)，到第6天表達(dá)明顯增強(qiáng)，并持續(xù)高表達(dá)至第15天(圖5)。

2.6 Notch信號(hào)分子表達(dá)變化

大鼠MSCs原代細(xì)胞高水平表達(dá)Notch1、Jagged1、Hey1和Hey2，中等表達(dá)Dll1、Dll3、Dll4、Notch2、Notch3和Notch4，下游靶基因Hes1和Hes5在肌分化過程中等量持續(xù)表達(dá)。miR-1重組慢病毒感染MSCs后，Jagged1、Notch1、Notch3和Hey2表達(dá)水平隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下調(diào)，其中配體Jagged1的含量下調(diào)最顯著 (表4)。而配體Dll1、Dll3和Dll4，受體Notch2和Notch4及靶基因Hes-1、Hes-5和Hey-1表達(dá)水平雖有波動(dòng)，但無顯著性差異(表5)。

A.control group; B.4-day group; C.6-day group; D.15-day group圖4 MSCsmiR-1中cTnI的表達(dá)Fig 4 Expression of cardiomyocyte-specific cTnI in MSCsmiR-1(×100)

*P<0.01 compared with control圖5 MSCsmiR-1中α-actin表達(dá)變化Fig 5 Expression of cardiomyocyte-specific α-actin in MSCsmiR-1

groupCt(Jagged1)Ct(Notch1)Ct(Notch3)Ct(Hey2)control 2130±032 2491±042 2399±039 2671±0344?day 2283±030? 2609±036 2284±048? 2807±057?6?day 2316±038?? 2708±046?? 2701±055?? 2703±042??15?day 2607±048?? 2728±051?? 2729±049?? 2833±039??

*P<0.05，**P<0.01 compared with control.

表5 Notch信號(hào)分子的表達(dá)變化Table 5 Expression of genes related to Notch signaling pathway

3 討論

miR-1作為首個(gè)確定的肌相關(guān)miRNAs，其調(diào)控機(jī)體心臟發(fā)育過程及心肌細(xì)胞分化的作用在一系列相關(guān)研究得到證實(shí)。敲除miR-1的小鼠心臟祖細(xì)胞的增殖明顯，而分化成的心肌細(xì)胞明顯減少[6]。在C2C12肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-1使得早期和晚期心肌相關(guān)基因表達(dá)增多，明顯促進(jìn)肌生成[7]。本研究結(jié)果同樣證實(shí)miR-1可促使大鼠MSCs向心肌細(xì)胞分化，并進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的前期研究[8]，表明miR-1具有決定干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化的作用。

在脊椎動(dòng)物的心臟發(fā)育的不同階段伴隨著Notch信號(hào)通路不同組分的時(shí)空表達(dá)變化，表明Notch信號(hào)通路在心臟發(fā)育的多個(gè)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9]。本研究中，miR-1重組慢病毒載體感染MSCs后，伴隨其向心肌樣細(xì)胞定向分化過程，Notch信號(hào)分子Jagged1、Notch1、Notch3及Hey2表達(dá)水平隨時(shí)間逐漸下調(diào)，推測(cè)Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2介導(dǎo)的Notch信號(hào)下調(diào)可能參與了miR-1誘導(dǎo)大鼠MSCs的心肌分化過程，并在其中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。一項(xiàng)關(guān)于爪蟾的研究發(fā)現(xiàn)，通過Notch1激活內(nèi)源性Notch信號(hào)通路可導(dǎo)致心肌分化標(biāo)志物cTnI、MHC和α-actin的下調(diào)，致使心肌細(xì)胞分化成熟障礙，抑制Notch信號(hào)通路則相反[10]。因此，心臟分化發(fā)育過程中Notch1介導(dǎo)的Notch信號(hào)下調(diào)具有重要的調(diào)控作用。研究中發(fā)現(xiàn)Notch3的表達(dá)變化與Notch1相一致，推測(cè)肌分化過程中Notch3具有類似Notch1的同向作用。關(guān)于未成熟心肌細(xì)胞的體外分化研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1通過激活Notch1在未成熟心肌細(xì)胞的分化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Jagged1可激活Notch3啟動(dòng)Notch信號(hào)通路調(diào)控心肌細(xì)胞的分化[12]。盡管實(shí)驗(yàn)背景有所不同，但Jagged1激活Notch1/ Notch3介導(dǎo)心肌細(xì)胞分化得到證實(shí)。Hey2特異性敲除的小鼠出現(xiàn)室間隔缺損、瓣膜發(fā)育異常，進(jìn)一步研究證實(shí)Hey2是Notch信號(hào)通路的重要效應(yīng)因子[13]。此外，一項(xiàng)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)Jagged1和Notch1敲除的小鼠中出現(xiàn)的心肌發(fā)育異常與Hey2敲除出現(xiàn)的一致，再次印證了Hey2為Notch信號(hào)的下游效應(yīng)因子[14]。由此可知，Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2介導(dǎo)的Notch信號(hào)下調(diào)在miR-1誘導(dǎo)大鼠MSCs的心肌分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。需要指出的是，盡管配體Dll1、Dll3、Dll4，受體Notch2、Notch4及靶基因Hes1、Hes5、Hey1表達(dá)水平亦隨MSCsmiR-1分化過程而波動(dòng)，但無顯著性差異。雖然上述基因均與心臟發(fā)育、胚胎發(fā)生有著密切的關(guān)系，但在miR-1介導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化過程中是否發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用證據(jù)不足，進(jìn)一步的研究有助于闡明其相關(guān)作用。

綜上所述，本研究通過miR-1慢病毒載體感染大鼠MSCs，證實(shí)miR-1可促使MSCs向心肌細(xì)胞分化，在此過程中Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2介導(dǎo)的Notch信號(hào)下調(diào)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究不僅為實(shí)現(xiàn)MSCs定向分化為心肌細(xì)胞找到了一條新途徑，同時(shí)對(duì)其分化機(jī)制也進(jìn)行了初步有益的探討。相信隨著研究的深入，MSCs向心肌細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制將逐步闡明，干細(xì)胞低分化效率的瓶頸也終將突破，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

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Expression of Notch signaling moleculesin the process of microRNA-1 inducing rat bone marrowmesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells

DENG Hai-yan1, ZENG Jun-yi2*, WEI Yun-feng1,2, WANG Meng-hong1,2, ZHENG Ze-qi1,2, ZHANG Wan2, WEN Tong1

(1.Dept of Cardiology;2.Jiangxi Institute of Hypertension，the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China)

ObjectiveTo investgate the effect of miR-1 on MSCs differentiation into cardiac phenotypes and the expression changes of Notch signaling molecules in this process.MethodsMSCs were isolated from rat bone marrow by the whole bone marrow adherence method; MSCs were introduced by the lentiviral vectors expressing miR-1(MSCsmiR-1),which were then divided into four groups: control group, 4-day culture group, 6-day culture group,15-day culture group;The cell morphology was examined by light microscopy, miR-1 and cardiomyocyte-specific genes including GATA- 4, cTnI and α-actin were examined by real-time qPCR, and the expression of cTnI and α-actin was detected by immunofluorescence and Western blot respectively;Meanwhile, MSCsmiR-1cells were detected for the expression of genes related to notch signaling pathway by qPCR.ResultsIsolated MSCs displayed a stable spindle-phenotype and showed characteristic swirling growth. More than 98% of the MSCs population expressed CD44 and CD29 for MSCs phenotype; Meanwhile, less than 1% cells were CD45 positive. MSCsmiR-1highly expressed miR-1 and showed a higher expression of cardiomyocyte-specific genes, including GATA-4, cTnI and α-actin, cTnI was detected by immunofluorescence in MSCsmiR-1after miR-1 transduction for 4 days, and gradually increased afterwards. Western blot further confirmed the expression of α-actin in MSCsmiR-1. The mRNA expression of Jagged1,Notch1,Notch3 and Hey2 reduced significantly in MSCsmiR-1during its differentiation into cardiomyocyte-like cells,and reached the minimum on day 15.ConclusionsTransduction of miR-1 into rat MSCs induce cell differentiation into cardiomyocyte-like cells,which is in company with down-regulation mRNA expression of Jagged1- Notch1/ Notch3-Hey2 in the Notch pathway.

miR-1； MSCs；cardiomyocyte-specific cells；notch

2013- 11- 18

2014- 03- 28

江西省自然科學(xué)基金(2010GZY0321)；江西省科技支撐計(jì)劃(2010BSA11700)；江西省教育廳青年科學(xué)基金(GJJ12153)；江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃(20111021)

*通信作者(correspondingauthor)：zjy1312@163.com

1001-6325(2014)09-1204-07

R 542.2

A