褚奇星，褚延樂

(1.平頂山市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 平頂山467000；2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

研究論文

LC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中鹽酸莫西沙星的含量及其藥動學(xué)

褚奇星1*，褚延樂2

(1.平頂山市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 平頂山467000；2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

目的建立一種靈敏、快速、專屬性好、選擇性強的HPLC-MS/MS分析法用于測定Beagle犬血漿樣品中鹽酸莫西沙星的含量，研究其藥動學(xué)。方法用HPLC-MS/MS法測定血漿中鹽酸莫西沙星的含量；以環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，色譜柱為XTerra@MS C18 5 μm, 2.1 mm×150 mm分析柱，流動相為甲醇-水(50∶50，v/v)，水相中含0.1%甲酸；流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣10 μL。檢測離子對分別為：莫西沙星m/z 402.1→m/z 384.3，內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星m/z 332.2→m/z 314.2。結(jié)果莫西沙星在10 μg/L～2 000 μg/L的范圍內(nèi)線性良好，最低定量限10 μg/L，準(zhǔn)確度在87.8%～111.6%之間，日內(nèi)、日間精密度(RSD)均≤11.6%，提取回收率gt;80%。犬口服給藥，血漿中鹽酸莫西沙星藥時曲線呈兩室模型，藥動學(xué)參數(shù)t1/2、tmax、AUC0-t、AUC0-∞、CL分別為10.7 h、2.1 h、3 943 μg/L·h、4 177 μg/L·h和10.5 L/h/kg。結(jié)論分析方法操作簡便、專屬性強、靈敏度高，適用于Beagle犬血漿中鹽酸莫西沙星含量測定及藥動學(xué)研究。

鹽酸莫西沙星；LC-MS/MS；Beagle犬；藥動學(xué)

鹽酸莫西沙星(moxifloxacin hydrochloride)為德國Bayer公司研制而成的第四代廣譜喹諾酮類抗菌藥[1-2]。通過抑制細(xì)菌DNA螺旋酶A亞單位和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的活性從而阻斷DNA復(fù)制，以發(fā)揮抗菌效果，具有廣譜、低毒、高效、生物利用度高及不良反應(yīng)少等優(yōu)點[3]。適用于敏感菌所致的呼吸道感染，包括慢支急性發(fā)作，輕度或中度獲得性肺炎，急性鼻竇炎等[4]。

目前，生物樣品中鹽酸莫西沙星的含量測定，主要采用紫外、熒光以及質(zhì)譜檢測法[5-6]，由于靈敏度與操作繁瑣程度的限制，都不能很好的為其藥動學(xué)研究提供靈敏、便捷的方法。本研究采用HPLC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中鹽酸莫西沙星的含量并用于其藥動學(xué)研究，闡明了鹽酸莫西沙星的藥動學(xué)特征，為其臨床藥動學(xué)和生物利用度研究提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸莫西沙星片(規(guī)格400 mg/片，批號：BJ09953，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，鹽酸莫西沙星對照品，純度99.6%，(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BXR 5E2A)(圖1)，環(huán)丙沙星對照品，純度99.8%，(中國藥品生物制品檢定所，批號：0125-7609)(圖2)，甲醇(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，其他試劑均為分析純。Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)。

圖1 鹽酸莫西沙星結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of Moxifloxacin hydrochloride

圖2 環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)式Fig 2 Chemical structure of Ciprofloxacin

1.2 動物

普通級成年Beagle犬6只，雌雄各半，體質(zhì)量10～12 kg，北京斯瑪特實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCXK (京)20120007。

1.3 色譜條件

色譜柱為XTerra@MS C18 5 μm, 2.1 mm×150 mm分析柱，預(yù)柱為XTerra@MS C18 5 m，2.1 mm×20 mm預(yù)柱，流動相為甲醇-水(50∶50，v/v)，水相含0.1%甲酸，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃。

1.4 質(zhì)譜檢測參數(shù)

離子源: 電噴霧離子化源(ESI)，正離子檢測模式；毛細(xì)管電壓:4.0 kV；脫溶劑氣(N2) 溫度:350 ℃；霧化器(N2)壓力: 0.24 MPa；干燥氣流速為10 L/min；掃描方式為多重反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)；莫西沙星的離子對為m/z 402.1→m/z 384.3 毛細(xì)管出口電壓(fragmentor)120 V；碰撞能量：CE=25 ev，內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星的離子對為m/z 332.2→m/z 314.2，毛細(xì)管出口電壓為135 V，用于分析的離子碰撞能量:CE=20 ev。

1.5 溶液的配制

鹽酸莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱取鹽酸莫西沙星對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為200 mg/L的鹽酸莫西沙星對照品儲備液；以甲醇：水(50∶50，v/v)稀釋儲備液，配制成鹽酸莫西沙星濃度為 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10和20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)溶液的配制:精密稱取定量環(huán)丙沙星，置100 mL容量瓶中，方法同莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，配得5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 血漿樣品前處理

精密吸取100 μL犬血漿置于5mL離心管中，加入100 μL飽和NaHCO3，渦旋混合30 s，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(鹽酸環(huán)丙沙星，5 mg/L)，渦旋混合30 s，加入乙酸乙酯1 mL，渦旋混合3 min，15 000×g離心10 min，取上清液800 μL于另一離心管中，真空濃縮儀40 ℃濃縮揮干，殘渣以100 μL流動相復(fù)溶，上清液LC-MS/MS進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL。

1.7 藥動學(xué)實驗

犬6只，雌雄各半，依次稱重，按照給藥劑量20 mg/kg，口服給予鹽酸莫西沙星片，于給藥前及給藥0.083、0.167、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36和48 h后于前肢隱靜脈取血1mL，血樣置于肝素抗凝的離心試管中，5 000×g離心5 min，取血漿100 μL，-20 ℃儲存至分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 分析方法專屬性：在上述色譜條件下，鹽酸莫西沙星(圖3)和內(nèi)標(biāo)物環(huán)丙沙星(圖4)的保留時間分別是：2.32 min和1.62 min；得到犬空白血漿、空白血漿加鹽酸莫西沙星和內(nèi)標(biāo)(環(huán)丙沙星)標(biāo)準(zhǔn)品以及受試犬給藥后血漿樣品的典型色譜圖(圖5)。

圖3 莫西沙星質(zhì)譜圖Fig 3 MS/MS product-ion spectra of[M+H]+ of Moxifloxacin

圖4 環(huán)丙沙星質(zhì)譜圖Fig 4 MS/MS product-ion spectra of[M+H]+ of Ciprofloxacin

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限：取5mL帶塞離心試管8只，分別加入不同濃度的鹽酸莫西沙星對照品溶液各10 μL，按“血漿樣品前處理”項下操作，配制成鹽酸莫西沙星血漿濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000和2 000 μg/L的樣品，得到色譜圖(圖6)；以標(biāo)準(zhǔn)待測物濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Ai/As為縱坐標(biāo)，采用最小2乘法線性回歸，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0008x+0.0544(r2gt;0.99)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖7)，線性范圍10 μg/L～2000 μg/L。定量下限為10 μg/L，S/n=10；以S/n=3做為檢測限，檢測限達(dá)到了3 μg/L。

2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度：按“1.6”項下方法制備成莫西沙星的血漿濃度分別為20.0，200和1 600 μg/L的質(zhì)控(QC)樣品，每濃度5個樣本，連續(xù)測定3 d，計算質(zhì)控樣品的檢測濃度，計算方法的準(zhǔn)確度(accuracy)與日內(nèi)、日間精密度(RSD)(表1)，符合相關(guān)指導(dǎo)原則要求。

2.1.4 提取回收率：按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，制備20、200和1 600 μg/L血漿樣品各5份。記錄莫西沙星的峰面積(As)及其與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(R)，將測定結(jié)果的峰面積(As)與相同濃度對照品溶液直接進(jìn)樣得到峰面積(A)按下式計算提取回收率(%)=As/A×5/4×100%計算3種濃度的提取回收率(extraction recoveries)分別為(80.3±6.9)%、(89.1±5.6)%和(85.5±4.4)%，內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星的回收率為(89.4±7.2)%。

A.blank dog plasma; B.blank dog plasma spiked with Moxifloxacin at LLOQ (10 μg/L) and IS (500 μg/L); C.plasma sample taken at 1 hour after oral administration; tR 2.32 min, moxifloxacin; tR 1.62 min IS

圖5 典型色譜圖Fig 5 Typical chromatograms

2.1.5 穩(wěn)定性：樣品在處理前后及放置過程中的穩(wěn)定性檢測(表2)，在上述條件下RSD均小于10%。

2.2 藥動學(xué)結(jié)果

本方法被成功地應(yīng)用于Beagle犬體內(nèi)鹽酸莫西沙星藥動學(xué)研究，以20 mg/kg的劑量口服給予鹽酸莫西沙星后，得到Beagle犬體內(nèi)血藥濃度(c)時間(t)曲線(圖8)和主要藥動學(xué)參數(shù)(表3)。

表2 血漿樣品鹽酸莫西沙星穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Stability of Moxifloxacin hydrochloride during sample storage, preparation and determination(±s, n=5)

A～H.10 μg/L～2 000 μg/L圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點色譜圖FIg 6 Chromatograms of Moxifloxacin in the 8-point standard curve of Beagle dog plasma

圖7 Beagle犬血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 7 8-point standard curve of Moxifloxacin hydrochloride in dog plasma

compoundparametervaluemoxifloxacinhydrochloridet1/2hours10.7±1.7tmax/h 2.1±0.9AUC(0-t)μg/L·h3943±151AUC(0-∞)μg/L·h4177±227MRT(0-t)h 7.9±0.3MRT(0-∞)h 9.9±0.7CLsL/h·kg10.5±1.2VL/kg135±42.6

3 討論

本實驗采用靈敏度高、特異性強的HPLC-MS/MS法用于莫西沙星在犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究，目前國內(nèi)尚未見報道。在以上色譜及質(zhì)譜條件下，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測定，鹽酸莫西沙星和內(nèi)標(biāo)物與內(nèi)源性物質(zhì)能充分分離，方法快速、簡便，方法學(xué)驗證結(jié)果均符合生物樣品測定要求。

圖8 Beagle犬口服鹽酸莫西沙星后經(jīng)時平均血藥濃度曲線Fig 8 Mean plasma concentration-time profile of Moxifloxacin hydrochloride in plasma after oral administration to six Beagle dogs(n=6)

Beagle犬口服給藥鹽酸莫西沙星后體內(nèi)藥動學(xué)結(jié)果顯示，鹽酸莫西沙星藥時曲線符合兩室開放模型，與人體藥動學(xué)情況一致[7]。本研究建立高效的液質(zhì)聯(lián)用分析法，實現(xiàn)了體內(nèi)莫西沙星的快速、準(zhǔn)確測定，為其臨床藥動學(xué)以及生物利用度研究提供了參考依據(jù)，并為在PK/PD基礎(chǔ)上優(yōu)化莫西沙星臨床給藥方案的研究[8]提供了簡便的研究方法和可靠的理論依據(jù)。

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Determination of moxifloxacin hydrochloridein beagle dog plasma by LC-MS/MS and its application to pharmacokinetics

CHU Qi-xing1*, CHU Yan-le2

(1.Pharmaceutical Department, the First Peoples’ Hospital of Pingdingshan, Pingdingshan 467000;2.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)

ObjectiveTo establish a sensitive and specific LC-MS/MS method for the determination of moxifloxacin hydrochloride in Beagle dog plasma and to evaluate the pharmacokinetic profile.MethodsThe concentration of Moxifloxacin Hydrochloride was determined by LC-MS/MS with XTerra@MS C18 column (5 μm, 2.1 mm×150 mm). The mobile phase consisted of methanol-water (50∶50, v/v) with the flow rate of 0.2 mL/min. The injection volume was 10 μL. Ions of moxifloxacin and ciprofloxacin were m/z 402.1→m/z 384.3 (F=120 V, CE=25), m/z 332.2→m/z 314.2(135 V, CE=20).ResultsStandard calibration graph for moxifloxacin hydrochloride was linear over a curve range of 10 μg/L～2 000 μg/L(R2gt;0.99) and the low limit of quantification was 10 μg/L using a plasma sample of 100 μL. The intra-day and inter-day precision (RSD) were in line with analysis of the biological samples. RSD were less than 11.6%, the extraction recoveries were greater than 80%. The concentration-time curves of moxifloxacin hydrochloride were best fitted to a two compartment model. The main pharmacokinetic parameters of t1/2,tmax, AUC0-t, AUC0-∞and CL were 10.7 h, 2.1 h, 3 943 μg/L·h, 4 177 μg/L·h and

10.5 L/h·kg respectively.ConclusionsThe method was specific and suitable for the determination of moxifloxacin hydrochloride in Beagle dog plasma and to study the pharmacokinetic character.

moxifloxacin hydrochloride; LC-MS/MS; beagle dog; pharmacokinetics

2013-09-06

2013-12-23

*通信作者(correspondingauthor)：pdscqx@126.com

1001-6325(2014)05-0684-06

R 969.1

A