曹峰琦，陳 翀，劉 妍，白麗鵬，羅云萍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系，北京 100005)

研究論文

腫瘤pH微環(huán)境通過(guò)激活β-catenin/TCF4增強(qiáng)人乳腺癌腫瘤細(xì)胞的干性

曹峰琦，陳 翀，劉 妍，白麗鵬，羅云萍*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系，北京 100005)

目的探討酸性微環(huán)境對(duì)于乳腺癌腫瘤干細(xì)胞干性的影響及其作用機(jī)制。方法分別在pH 6.8和7.4的環(huán)境下，培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。用流式細(xì)胞術(shù)、PCR、Western blot、體外成球?qū)嶒?yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞ALDHhigh細(xì)胞亞群的比率，干性基因SOX2、OCT4和Lin28b的表達(dá)，成球能力和腫瘤細(xì)胞遷移能力，同時(shí)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路的激活。結(jié)果酸性微環(huán)境通過(guò)激活β-catenin/TCF4信號(hào)通路提高M(jìn)DA-MB-231的ALDHhigh細(xì)胞亞群的比例(Plt;0.05)，上調(diào)干性相關(guān)基因的表達(dá)(Plt;0.01)，增強(qiáng)體外成球能力(Plt;0.01)和遷移能力(Plt;0.05)。結(jié)論酸性微環(huán)境能夠上調(diào)干細(xì)胞比例，維持腫瘤干細(xì)胞干性特征，增加乳腺癌腫瘤細(xì)胞遷移能力。

乳腺癌；腫瘤干細(xì)胞；酸性微環(huán)境

腫瘤干細(xì)胞是一群具有高抗放化療特性，能自我更新，自我修復(fù)，具有多向分化潛能，能夠在體外形成克隆的一群比例極小的細(xì)胞亞群，目前認(rèn)為是造成腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源之一[1-3]。近幾年在多種惡性腫瘤組織中都成功的分離出了腫瘤干細(xì)胞，為腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)提供了充分的證據(jù)支持[4-6]。雖然腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中所占的比例極少，但他們獨(dú)特的干細(xì)胞表型是腫瘤逃逸常規(guī)的放化療，導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因[7-8]。

腫瘤干細(xì)胞干性的維持需要其所處的微環(huán)境的支持。大量的研究證實(shí)，惡性腫瘤組織周圍的pH值在6.8～6.0之間，甚至更低達(dá)5.8。而正常組織周圍的pH值一般穩(wěn)定保持在7.35～7.45之間[9-11]。長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為酸性微環(huán)境是低氧造成的，而忽略了腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的代謝型--瓦伯格效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞無(wú)論是有氧還是低氧環(huán)境下都進(jìn)行糖酵解反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量的乳酸和氫離子外排，進(jìn)而形成了酸性微環(huán)境。

已有的研究主要都放在了低氧微環(huán)境對(duì)于腫瘤干細(xì)胞干性的維持方面，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道酸性微環(huán)境對(duì)于腫瘤干細(xì)胞干性的影響，本研究主要探討酸性微環(huán)境對(duì)于乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的作用，并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗、100×青霉素-鏈霉素溶液、100×非必需氨基酸(NEAA)和HEPES緩沖液(GIBCO公司)； MES緩沖液(Sigma公司)。ALDH檢測(cè)試劑盒(StemCell公司)。兔抗人OCT4，SOX2，Nanog，Lin28b，β-catenin及TCF4抗體(Cell Signaling Technology公司)。鼠抗人HIF1α抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗(青鏈霉素溶液)和1%非必需氨基酸(NEAA)的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，細(xì)胞匯合至80%～90%后用胰蛋白酶消化傳代。分別利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液和2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH為7.4或6.8。分別在pH為7.4和6.8的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ALDHhigh細(xì)胞群比例： 將2 mL MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，分為兩組，每組3孔，分別為pH值為7.4的對(duì)照組和pH值為6.8的實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)12和24 h后，消化收集細(xì)胞，300×g離心5 min，PBS漂洗3次，吹打成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，重懸于ALDH 測(cè)定緩沖液，并按照ALDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)ALDHhigh細(xì)胞群比例。

1.3.2 PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)： 將2 mL MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，分為兩組，每組3孔，分別為pH值為7.4的對(duì)照組和pH值為6.8的實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)12 h后，按常規(guī)Trizol法提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應(yīng)用特定基因引物進(jìn)行RT-PCR和real-time PCR反應(yīng)。

1.3.3 Western blot檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)： MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞分別在pH值7.4和pH值6.8的環(huán)境下培養(yǎng)12 h，PBS漂洗3次，提取細(xì)胞總蛋白。傳統(tǒng)Western blot方法進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，敷抗體，顯影。

1.3.4 體外成球?qū)嶒?yàn)： 新鮮配制成球培養(yǎng)基即DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)添加2%的B27、20 ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、20 ng/mL的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和1%的雙抗。分別利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液和2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH為7.4或6.8。以5 000個(gè)/孔接種MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞于6孔板，5 d后統(tǒng)計(jì)成球量，計(jì)算其成球能力。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)： 6孔板接種MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞，待細(xì)胞完全布滿孔底部，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用黃槍頭在每個(gè)孔中平直劃一道線，然后將孔中培養(yǎng)基換成經(jīng)4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液和2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.4或6.8的含1%胎牛血清的培養(yǎng)基；每道劃痕選取3個(gè)獨(dú)立視野拍照，分別記錄0 和24 h后鏡下劃痕的寬度，然后根據(jù)平均值計(jì)算每道劃痕的寬度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1酸性微環(huán)境增加人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231腫瘤干細(xì)胞ALDHhigh細(xì)胞群比例

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231在pH為6.8的微環(huán)境下培養(yǎng)12 h，其腫瘤干細(xì)胞ALDHhigh細(xì)胞亞群比率(21.7%±0.07%)相比于在pH為7.4的微環(huán)境下培養(yǎng)者(5.88%±0.23%)，有顯著的增高(Plt;0.01)(圖1A)。分別在pH為6.8的微環(huán)境下(12.40%±0.85%)和pH為7.4的微環(huán)境下(5.07%±0.56%)培養(yǎng)24 h，酸性微環(huán)境下其腫瘤干細(xì)胞ALDHhigh細(xì)胞亞群比率也同樣有明顯的增高(Plt;0.05)(圖1B)。

A.treated by 12 hours; B.treated by 24 hours; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with pH 7.4 control group圖1 MDA-MB-231細(xì)胞在不同pH微環(huán)境下培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞ALDHhigh細(xì)胞群比例

2.2酸性微環(huán)境上調(diào)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231干性基因的表達(dá)

與在pH為7.4的微環(huán)境下培養(yǎng)相比，酸性微環(huán)境可以顯著上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞OCT4、SOX2和Lin28b等干性基因RNA水平(圖2A，B)和蛋白質(zhì)水平(圖2C)的表達(dá)。

2.3酸性微環(huán)境提高人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231體外成球能力

在pH為7.4的微環(huán)境下， MDA-MB-231細(xì)胞體外成球能力為8.57%±0.12%。而在pH為6.8的微環(huán)境下，MDA-MB-231細(xì)胞體外成球能力顯著提高至12.47%±0.18%(Plt;0.01)(圖3)。

2.4酸性微環(huán)境增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的遷移能力

在pH為7.4的微環(huán)境下， MDA-MB-231細(xì)胞的24 h遷移率為0.07%±0.02%。而在pH為6.8的微環(huán)境下，MDA-MB-231細(xì)胞的24 h遷移率顯著增強(qiáng)，達(dá)到0.17%±0.03%(Plt;0.05)(圖4)。

A.RT-PCR; B.real-time PCR; C.Western blot; *Plt;0.01, **Plt;0.001 compared with pH 7.4 control group圖2 不同pH微環(huán)境下MDA-MB-231細(xì)胞干性基因的表達(dá)結(jié)果Fig 2 The expression of stemness genes in MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium

A.sphere test(×100); B.quantitative results; *Plt;0.01 compared with pH 7.4 control group圖3 不同pH微環(huán)境下MDA-MB-231細(xì)胞體外成球功能Fig 3 Sphere formation of MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium(×100)

2.5酸性微環(huán)境可以激活β-catenin/TCF4信號(hào)通路

與正常微環(huán)境相比，酸性微環(huán)境下β-catenin/TCF4信號(hào)通路的活化程度更高，而且轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá)也有明顯上調(diào)(圖5)。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞理論對(duì)于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，大量的研究已經(jīng)明確了炎性微環(huán)境[12-13]，低氧微環(huán)境等對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的作用，而酸性微環(huán)境與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系卻鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH來(lái)模擬微環(huán)境的酸性程度，以pH 6.8模擬腫瘤酸性微環(huán)境，pH 7.4模擬正常微環(huán)境[14]。分別在酸性微環(huán)境和正常微環(huán)境下培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，探究酸性微環(huán)境對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用。

A.mobility test(×40); B.quantitative results; *Plt;0.05 compared with pH 7.4 control group圖4 不同pH微環(huán)境下MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力Fig 4 The mobility of MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium(×40)

A.Western blot; B.RNA level of TCF4; *Plt;0.05 compared with pH 7.4 control group圖5 酸性微環(huán)境激活β-catenin/TCF4信號(hào)通路Fig 5 The activation of β-catenin/TCF4 signaling pathway by the acidic microenvironment

腫瘤干細(xì)胞研究的難點(diǎn)在于腫瘤干細(xì)胞所占的比例微乎其微，而且對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的鑒定也沒(méi)有一個(gè)普遍適用的標(biāo)準(zhǔn)，并沒(méi)有一種能夠適用于所有腫瘤細(xì)胞的篩選標(biāo)志物，造成腫瘤干細(xì)胞的分選鑒定的困難，從而制約了對(duì)其的深入研究。本研究以ALDHhigh作為腫瘤干細(xì)胞的篩選標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境下，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的腫瘤干細(xì)胞比例有顯著地增多，而在pH 6.8條件下培養(yǎng)24h ALDHhigh細(xì)胞亞群比率相比于12 h有明顯下降，主要原因可能是非腫瘤干細(xì)胞的大量凋亡，造成腫瘤細(xì)胞群基數(shù)的增大；并且RNA水平和蛋白質(zhì)水平的結(jié)果顯示在酸性微環(huán)境下，干性相關(guān)基因的表達(dá)，如OCT4、SOX2和Lin28b都有明顯的上調(diào)。Lin28b作為一個(gè)保守的RNA結(jié)合蛋白，與干性的調(diào)節(jié)與代謝都有一定的關(guān)聯(lián)，可能在酸性微環(huán)境中干性調(diào)節(jié)中起著重要的作用，有待于進(jìn)一步探討。體外成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境能夠促進(jìn)體外成球。同時(shí)，腫瘤的遷移能力也被認(rèn)為與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)，結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境也可以顯著增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的遷移能力。所有的結(jié)果均提示，酸性微環(huán)境有利于提高腫瘤干細(xì)胞比例，顯著上調(diào)干性相關(guān)基因的表達(dá)，維持腫瘤細(xì)胞干性。

而對(duì)于酸性微環(huán)境對(duì)于干性的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境可以激活β-catenin/TCF4信號(hào)通路以及上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá)，提示酸性微環(huán)境可以通過(guò)激活β-catenin/TCF4信號(hào)通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HIF1α，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)干性的調(diào)控。

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The tumor pH microenvironment enhance stemnessproperties via β-catenin/TCF4 activation in human breast cancer cells

CAO Feng-qi, CHEN Chong, LIU Yan, BAI Li-peng, LUO Yun-ping*

(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS，School of Basic Medicine, PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate the effects of acidic tumor microenvironment on maintaining stemness and underneath mechanism in breast cancer stem cells.MethodsHuman breast cancer cell MDA-MB-231 with either pH 6.8 or pH 7.4 medium, the percentage of ALDHhighsubpopulation, the expression of SOX2, OCT4, Lin28b and the stemness properties were detected by using FCM, Real-time PCR, Western blot, sphere test and scratch experiments. The activation of signaling pathway was also examined.ResultsAll stemness properties of MDA-MB-231 cell cultured with pH 6.8 conditional medium were increased including the percentage of ALDHhighsubpopulation(Plt;0.05), the expression of stemness gene(Plt;0.01), the capability of sphere formation(Plt;0.01) and cell mobility(Plt;0.05). These stemness properties of MDA-MB-231 cell were regulated via β-catenin/TCF4 signaling pathway that activated by pH 6.8 cultured medium.ConclusionsThe acidic tumor microenvironment increases the percentage of ALDHhighsubpopulation and enhances stemness phenotypes of breast cancer cells.

breast cancer; cancer stem cells; acidic microenvironment

2014-02-17

2014-03-12

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB967202)

*通信作者(correspondingauthor)：yunpingluo@hotmail.com

1001-6325(2014)05-0622-06

R 73-35+4

A