文 藝，馮 犁，張少華，陳振宇，閆洪濤，陳 濤，湯禮軍*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué) 研究生管理大隊(duì)，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心，四川 成都 610083)

研究論文

Roux-en-Y胃旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟糖異生的影響

文 藝1，馮 犁2，張少華2，陳振宇2，閆洪濤2，陳 濤2，湯禮軍2*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué) 研究生管理大隊(duì)，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心，四川 成都 610083)

目的研究胃旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟糖異生的影響，探討其可能的降糖機(jī)制。方法建立2 型糖尿病大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組，糖尿病模型組，假手術(shù)組和手術(shù)組。分別于術(shù)前及術(shù)后4周檢測各組大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和游離脂肪酸(FAA)；術(shù)前及術(shù)后1、2和4周，檢測各組大鼠空腹胰島素，行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)，計(jì)算血糖濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)和胰島素敏感指數(shù)(ISI)。術(shù)后4周，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot雜交技術(shù)檢測腎臟組織中糖異生關(guān)鍵酶：葡萄糖6磷酸酶(G-6-P)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)的mRNA表達(dá)及蛋白含量。結(jié)果術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠較糖尿病模型和假手術(shù)組血脂相關(guān)指標(biāo)降低(Plt;0.05)，空腹血糖及OGTT 2 h血糖值明顯下降(Plt;0.05)，AUC明顯減小(Plt;0.05)，ISI明顯升高(Plt;0.05)，手術(shù)組G-6-P和PEPCKmRNA的表達(dá)及蛋白含量較糖尿病模型組和假手術(shù)組均有降低(Plt;0.05)。結(jié)論胃旁路術(shù)能顯著降低糖尿病大鼠血糖，改善異常的糖耐量，其降糖機(jī)制可能與腎臟糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)降低，腎臟糖異生減弱有關(guān)。

胃旁路術(shù)；Roux-en-Y；糖尿?。荒I臟；糖異生

糖尿病已成為威脅人類健康的主要慢性疾病之一，其中90%以上為2型糖尿病。目前以飲食控制和口服降糖藥物的治療方式對(duì)血糖的長期控制并不理想,胰島素的替代治療也只能解決暫時(shí)的問題。相較于傳統(tǒng)治療，以Roux-en-Y胃旁路術(shù)為代表的減重手術(shù)對(duì)2型糖尿病的治療取得意想不到效果，手術(shù)不僅能明顯的改善2型糖尿病患者的血糖、胰島素和糖化血紅蛋白，同時(shí)也可糾正糖耐量異常和胰島素抵抗[1]，近期報(bào)道[2]手術(shù)對(duì)2型糖尿病的治療效果明顯優(yōu)于單純的藥物治療。然而目前對(duì)其確切的降糖機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本研究采用高脂高糖飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素建立大鼠2 型糖尿病模型，觀察胃旁路術(shù)對(duì)腎臟糖異生的影響，對(duì)胃旁路術(shù)的降糖作用及其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)8周齡SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量170～190 g[簡陽達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào):SCXK(川)2004)]。高脂飼料由基礎(chǔ)鼠飼料(72%)、煉豬油(15%)、蔗糖(10%)和蛋黃(3%)按比例搭配制成高脂高糖飼料。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L、pH 7.4)，胰島素放免試劑盒(海博研生物科技有限公司)，Trizol(碧云天生物技術(shù)研究所)，反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒(TAKARA R0086A)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，山羊抗兔IgG (武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗PEPCK多克隆抗體(Santa Cruz sc-32879)和兔抗G-6-P多克隆抗體(Santa Cruz sc-25840)(圣克魯斯生物技術(shù)公司)

1.3 糖尿病動(dòng)物模型復(fù)制、分組及處理

將大鼠分為對(duì)照組(8只)和糖尿病模型動(dòng)物(32只),對(duì)照組動(dòng)物給予基礎(chǔ)飼料，建模動(dòng)物給予高脂飼料。喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg[3]。模型穩(wěn)定1周后，將糖尿病大鼠30只隨機(jī)分為糖尿病模型組8只，假手術(shù)組8只和手術(shù)組14只。假手術(shù)組行胃竇十二指腸離斷原位吻合術(shù)，手術(shù)組行胃旁路術(shù)，大鼠術(shù)前禁食12 h，不限飲水，0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，無菌條件下，上腹部正中切口長3 cm切開進(jìn)腹，閉合胃遠(yuǎn)端，距Treitz韌帶10 cm切斷空腸，遠(yuǎn)端腸襻行胃空腸吻合，距胃腸吻合口遠(yuǎn)端10 cm行空腸側(cè)側(cè)吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL沖洗腹腔后關(guān)腹，手術(shù)14只，存活4周8只，存活率57.1%。

1.4 檢測方法

1.4.1 大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和游離脂肪酸(FFA)測定：分別于術(shù)前及術(shù)后4周，采用全自動(dòng)生化分析儀測定各組大鼠總膽固醇和甘油三酯，ELISA法測定游離脂肪酸。

1.4.2 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)：術(shù)前及術(shù)后1、2和4周，禁食12 h后，50%葡萄糖灌胃1.5 g/kg，取大鼠尾尖血分別測定給葡萄糖后0、0.5、1和2 h的血糖值，用梯形法按式AUC=0.25×(0 h血糖濃度+4×0.5 h血糖濃度+3×2 h血糖濃度)計(jì)算血糖濃度-時(shí)間曲線下面積(area under the curve,AUC)。

1.4.3 大鼠血清Insulin測定：術(shù)前及術(shù)后1、2和4周，采用放射免疫法測定各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)空腹血清胰島素水平。

1.4.4 計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(Insulin sensitivity index，ISI)：ISI=1/(空腹血糖×空腹胰島素)，分析時(shí)取其自然對(duì)數(shù)值，即ISI=In(空腹血糖×空腹胰島素)-1

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P mRNA的表達(dá)水平：采用Trizol法提取腎臟皮質(zhì)總RNA，嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行。用Thermo NanoDrop2000分光光度儀檢測RNA 的含量和純度，取A260/A280在1.8～2.1 之間的RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物由上海生工合成，為相對(duì)定量檢測mRNA 表達(dá)量，用β-actin作為內(nèi)參(表1)。采用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒配制25 μL體系， BIO-RAD C1000進(jìn)行目標(biāo)序列擴(kuò)增，用2-△△Ct法分析磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G-6-P)mRNA 的水平變化。

1.4.6 Western blot檢測腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P的蛋白表達(dá)：采用BCA法定量總蛋白，取40 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白, 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h，封閉后分別加入兔抗PEPCK多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗G-6-P多克隆抗體(1∶800)，4 ℃雜交過夜。洗膜后用辣根過氧化物酶酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫下二抗雜交1 h, 洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色, 暗室曝光成像，應(yīng)用UVP BioSpectrum 410 Imaging System分析密度并計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Tch、TG、FFA的檢測結(jié)果

術(shù)前與對(duì)照組相比，糖尿病模型組Tch、TG和FFA均有明顯升高(Plt;0.05)；術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠較糖尿病模型組和假手術(shù)組，Tch、TG和FFA均有降低(Plt;0.05)(表2)。

2.2 各組大鼠OGTT實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果

術(shù)前糖尿病模型組空腹血糖及OGTT 2 h血糖均顯著高于對(duì)照組(Plt; 0.05)；術(shù)后，手術(shù)組空腹血糖及OGTT 2 h血糖呈明顯下降趨勢(shì)，術(shù)后4周其血糖值顯著低于糖尿病對(duì)照和假手術(shù)組(Plt;0.05)(表3)。

2.3各組血糖濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)的檢測結(jié)果

術(shù)前糖尿病模型組AUC顯著高于對(duì)照組(Plt;0.05)；術(shù)后，手術(shù)組AUC較糖尿病模型組和假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.05)(表4)。

2.4各組大鼠空腹胰島素和胰島素敏感指數(shù)的檢測結(jié)果

術(shù)前，糖尿病模型組胰島素敏感指數(shù)較對(duì)照組明顯降低(Plt;0.05)；術(shù)后1周，手術(shù)組較糖尿病模型組和假手術(shù)組胰島素敏感指數(shù)即明顯升高，空腹胰島素水平降低(Plt;0.05)，手術(shù)效果一直維持到術(shù)后4周(表5)。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件Table 1 Sequences and conditions of primers in used in PCR

表2 各組大鼠血脂相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 2 The results of blood-lipoid indexes in each group(±s, mmol/L,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

表3 各組大鼠血糖的檢測結(jié)果Table 3 The results of blood glucose in each group (±s, mmol/L,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

表4 各組大鼠AUC的檢測結(jié)果Table 4 The results of AUC in each group (±s, mmol/h·L,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

表5 各組大鼠空腹胰島素和胰島素敏感性的檢測結(jié)果Table 5 The results of insulin (mIU/L) and ISI in each group(±s,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

2.5各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-PmRNA相對(duì)表達(dá)的檢測結(jié)果

術(shù)后4周，糖尿病模型組及假手術(shù)組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-PmRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組大鼠(Plt;0.05)，分別升高了近6倍和4倍；手術(shù)組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-PmRNA的表達(dá)較糖尿病模型組及假手術(shù)組均有降低，尤以G-6-P降低明顯(Plt;0.05)(表6)。

表6 各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P mRNA表達(dá)的比較

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

2.6各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-P蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果

術(shù)后4周，糖尿病模型組及假手術(shù)組PEPCK和G-6-P的蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組大鼠(Plt;0.05)，手術(shù)組大鼠PEPCK和G-6-P的蛋白表達(dá)較糖尿病模型組和假手術(shù)組均有降低(Plt;0.05)(表7，圖1)。

表7 各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P蛋白表達(dá)的比較

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

圖1 各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P蛋白表達(dá)的比較Fig 1 The expressions of PEPCK and G-6-P protein in each group(±s,n=8)

3 討論

Roux-en-Y胃旁路術(shù)是目前治療2型糖尿病的新手段和主要手術(shù)方法，其臨床治療有效率達(dá)80%以上[4]。長期隨訪調(diào)查顯示胃旁路術(shù)后患者血糖控制穩(wěn)定，胰島素抵抗改善明顯，患者血脂、血壓等也有一定程度改善，降低了糖尿病并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素及發(fā)病率，是一種有效的治療方式[5]。

2型糖尿病主要是以胰島素抵抗為主，使人體器官和組織對(duì)胰島素敏感性降低，致人體對(duì)糖的利用減少，內(nèi)源性糖生成增多。而內(nèi)源性糖的來源主要有兩條途徑：一是糖原的分解，二是糖異生。2型糖尿病患者上述兩條生糖途徑都有不同程度的增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致餐后和空腹的高血糖。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎臟具有在各種生理和病理?xiàng)l件下產(chǎn)生和釋放糖的能力，腎臟對(duì)血糖穩(wěn)態(tài)的重要作用已經(jīng)得到公認(rèn)[6]。除了肝臟，腎臟皮質(zhì)也含有大量糖異生相關(guān)的酶，且腎臟是唯一能夠通過糖異生產(chǎn)生足夠多的糖并釋放進(jìn)入血液循環(huán)的器官[6]。研究顯示腎糖產(chǎn)量占人體內(nèi)源性糖產(chǎn)量近20%，約占糖異生途徑的40%[7]。而2型糖尿病患者內(nèi)源性糖的產(chǎn)量增加了近300%，肝糖和腎糖的釋放各占50%，糖尿病患者與非糖尿病患者相比，其腎糖的釋放增加了近3倍，然而肝糖的釋放只增加了30%[8]。此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，糖尿病大鼠腎臟糖異生關(guān)鍵酶基因的表達(dá)、酶的活性都是增加的，且腎臟與肝臟G-6-P基因的表達(dá)和酶的活性增加幾乎相同[9]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P的基因和蛋白表達(dá)均明顯升高，腎臟糖異生增強(qiáng)。

本研究建立的2型糖尿病大鼠模型，與對(duì)照組大鼠相比，該模型大鼠血脂偏高，血糖中度升高，胰島素敏感性指數(shù)降低，糖耐量嚴(yán)重受損，與2型糖尿病的病理生理特點(diǎn)基本一致。對(duì)糖尿病大鼠實(shí)施胃旁路術(shù)后1周，其空腹血糖即明顯降低，胰島素敏感性增加，受損的糖耐量得到改善，表明手術(shù)具有快速且顯著的降糖效果，這也與前期的研究結(jié)果一致[10]。術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠血糖水平趨于穩(wěn)定，腎臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G-6-P的基因及蛋白表達(dá)較糖尿病大鼠均有一定程度降低，腎臟糖異生減弱。手術(shù)組大鼠腎臟糖異生的減弱可能跟其術(shù)后胰島素敏感性增加有關(guān)，有研究報(bào)道胰島素可以通過下調(diào)糖異生關(guān)鍵酶基因的表達(dá)而對(duì)糖異生起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[11]，抑制肝臟和腎臟內(nèi)源性糖的產(chǎn)生[12]，因此推測腎糖輸出的減少可能主要和胰島素的作用有關(guān)。其次，胃旁路術(shù)后諸多胃腸道激素及脂肪因子的分泌會(huì)發(fā)生改變[13]，是否有其他的因素在其中產(chǎn)生作用都仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上，Roux-en-Y胃旁路術(shù)能迅速降低糖尿病大鼠血糖，改善受損糖耐量，其機(jī)制可能跟術(shù)后降低腎臟糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)，抑制腎臟糖異生有關(guān)。

[1] 湯禮軍,陳濤,崔建峰,等. 胃旁路術(shù)治療非肥胖型2型糖尿病的近期療效[J]. 中華消化外科雜志,2011,10:214-216.

[2] Mingrone G, Panunzi S, De Gaetano A,etal. Bariatric surgery versus conventional medicaltherapy for type 2 diabetes[J]. N Engl J Med,2012,366:1577-1585.

[3] K. Srinivasan, B. Viswanad, Lydia Asrat,etal.Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treatedrat: A model for type 2 diabetes and pharmacological screening[J]. Pharmacol Res,2005,52:313-320.

[4] Yan HT, Tang LJ, Chen T,etal. Defining and predicting complete remission of type 2 diabetes: a short-term efficacy study of open gastric bypass[J].Obes Facts, 2013,6:176-184.

[5] Rubino F, Schauer PR, Kaplan LM,etal. Metabolic surgery to treat type 2 diabetes: clinical outcomes and mechanisms of action[J]. Annual Rev Med, 2010,61:393-411.

[6] Triplitt CL.Understanding the kidneys’ role in blood glucose regulation[J].Am J Manag Care,2012,18:11-16.

[7] Meyer C, Stumvoll M, Dostou J,etal. Renal substrate exchange and gluconeogenesis in normal postabsorptive humans[J]. Am J Physiol,2002,282: 428-434.

[8] Meyer C,Woerle HJ,Dostou JM,etal.Abnormal renal,hepatic,and muscle glucose metabolism following glucose ingestion in type 2 diabetes[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2004,287:1049-1056.

[9] Asimina Mitrakou.Kidney: Its impact on glucose homeostasis and hormonal regulation[J].Diabetes Res Clinical Practi,2011, 93:66-72.

[10] 伍松,唐均成,鄒洪,等.Roux-en-Y胃旁路術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟糖異生的影響[J].中華消化外科雜志,2012,15:1142-1145.

[11] DeFronzo RA, Davidson JA, Del Prato S. The role of the kidneys in glucose homeostasis: a new path towards normalizing glycaemia[J].Diabetes Obes Metab,2012,14:5-14.

[12] Pillot B, Soty M, Gautier-Stein A,etal.Protein feeding promotes redistribution of endogenous glucose production to the kidney and potentiates its suppression by insulin[J]. Endocrinology, 2009,150:616-624.

[13] 馮蘇,賈高磊,王小凱,等. 膽胰轉(zhuǎn)流術(shù)改善2型糖尿病的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2014,34: 278-281.

Effect of Roux-en-Y gastric bypass surgeryon renal gluconeogenesis in type 2 diabetes mellitus rats

WEN Yi1, FENG Li2, ZHANG Shao-hua2, CHEN Zhen-yu2, YAN Hong-tao2, CHEN Tao2, TANG Li-jun2*

(1.Administration Office of Graduate Students，Third Military Medical University，Chongqing 400038;2.Center of General Surgery，General Hospital of Chengdu Military Command，Chengdu 610083，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Roux-en-Y gastric bypass surgery on renal gluconeogenesis in type 2 diabetes mellitus rats, and explore its possible hypoglycemic mechanism.MethodsTo build diabetes mellitus animal models. Diabetic rats were divided into four groups randomly: control group, diabetes model group (DM group),sham Roux-en-Y gastric bypass group (SRYGB group), Roux-en-Y gastric bypass group (RYGB group). Plasma TG,TC and FFA were measured respectively before and 4th week after the operation in each group rats; the fasting insulin was measured and OGTT was taken before and 1st,2nd and 4th week after the operation, calculate the AUC of blood glucose concentration-time and ISI. The key enzymes of renal gluconeogenesis: G-6-P and PEPCK were detected using RT-PCR and Western blot respectively 4th week after the operation in each group rats.Results4 weeks after surgery,RYGB group rats were compared with DM and SRYGB group rats,Roux-en-Y gastric

bypass surgery can reduce the level of blood lipid (Plt;0.05) and decrease the fasting blood glucose of as well as 2 h after OGTT significantly (Plt;0.05), reduce the AUC (Plt;0.05), increase insulin sensitivity(Plt;0.05),decrease expression ofG-6-PandPEPCKmRNA and protein in some degree.ConclusionsRoux-en-Y gastric bypass surgery can reduce blood glucose in diabetic rats significantly and improve the glucose tolerance, its mechanism may be related to decrease of G-6-P and PEPCK mRNA and protein levels in renal tissue，weaken renal gluconeogenesis.

gastric bypass surgery；Roux-en-Y；diabetes mellitus；kidney；gluconeogenesis

2013-12-20

2014-03-12

全軍臨床高新技術(shù)重大項(xiàng)目(2010gxjs040)

*通信作者(correspondingauthor)：whjtlj1251@163.com

1001-6325(2014)05-0661-06

R 656.6；R 587.1

A