左強(qiáng)強(qiáng)，鄭威楠，張金莉, 李玉華, 劉引引，龍海晨，潘澤民*

(1.石河子大學(xué) 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)教研室, 新疆 石河子 832002；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院 病理科，新疆 喀什 844000)

研究論文

IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的相關(guān)性

左強(qiáng)強(qiáng)1，鄭威楠1，張金莉2, 李玉華1, 劉引引1，龍海晨1，潘澤民1*

(1.石河子大學(xué) 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)教研室, 新疆 石河子 832002；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院 病理科，新疆 喀什 844000)

目的探討IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的相關(guān)性以及早期診斷的可行性，分析IFITM1基因甲基化對(duì)mRNA表達(dá)的影響。方法采用甲基化特異性PCR方法和HPV16、HPV18特異的PCR方法分別檢測(cè)了40例正常子宮頸組織和40例新疆維吾爾族婦女子宮頸癌組織的IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化情況和高危險(xiǎn)性HPV的感染情況，并分析兩個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性。用RT-PCR方法檢測(cè)10例甲基化陽(yáng)性和10例甲基化陰性的組織IFITM1基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果31例子宮頸癌組織IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化，3例子宮頸正常組織發(fā)生甲基化，在子宮頸癌中高危險(xiǎn)性HPV的感染例數(shù)為27例，在正常組織中為5例。40例子宮頸癌組織中， HPV16、HPV18感染陽(yáng)性的組織IFITM1基因甲基化的發(fā)生率增高(Plt;0.05)，在10例甲基化陽(yáng)性的組織中IFITM1基因mRNA的表達(dá)水平明顯低于10例甲基化陰性的組織(Plt;0.01)。結(jié)論IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化是子宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，具有大規(guī)模臨床篩選試驗(yàn)的價(jià)值。

IFITM1基因；基因啟動(dòng)子甲基化；HPV；子宮頸癌

子宮頸癌是女性常見(jiàn)腫瘤，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致女性死亡的重要疾病。人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染與子宮頸癌高度相關(guān)。當(dāng)前，大量科學(xué)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，抑癌基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌的發(fā)生中起了重要作用[1-2]，已成為當(dāng)今研究腫瘤發(fā)病分子機(jī)制和治療的熱點(diǎn)[3]。

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(IFITM1)基因產(chǎn)物是淋巴細(xì)胞上參與傳遞抗增殖和同型的黏附信號(hào)復(fù)合體的白細(xì)胞抗原之一。在慢性髓性白血病的低危組中IFITM1表達(dá)水平要比高危組的高，且表達(dá)水平高的預(yù)后好[4]。在前期研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)子宮頸癌組織中IFITM1基因mRNA表達(dá)水平降低[5]，IFITM1基因有可能是候選抑癌基因。但是其在子宮頸癌中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究分析了IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化，hr-HPV 感染和mRNA的表達(dá)情況的關(guān)系，為IFITM1基因在子宮頸癌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

所有標(biāo)本來(lái)自2009至2012年期間新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，石河子大學(xué)附屬醫(yī)院未經(jīng)過(guò)化療和放療的維吾爾族婦女宮頸手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本和活檢新鮮組織標(biāo)本，所有取材均取得患者知情同意。

1.2 DNA的提取

用SK1252基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取組織DNA。步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 DNA的亞硫酸氫鹽修飾

參照CpGenomeTMDNA Modification Kit S7820試劑盒(Chemicon公司)手冊(cè)說(shuō)明對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理修飾并純化，修飾后的DNA置-80 ℃保存。

1.4 甲基化特異性PCR

甲基化和非甲基化正向和反向引物序列參照文獻(xiàn)[7](表1)，使用 Bio-Rad 梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，康為世紀(jì)PCR反應(yīng)Mix，25 μL反應(yīng)體系包括：修飾后的DNA模板 1 μL，0.5 μmol/L的正向與反向引物各0.5 μL，Mix 12.5 μL，滅菌水 10.5 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃×1 min，58 ℃×1 min：72 ℃×1 min，共34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min。最后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 RNA的提取

取出-80 ℃保存的IFITM1基因甲基化陽(yáng)性和陰性的子宮頸組織各10例，每例樣本30 mg，使用液氮在研缽中研成粉末，用Trizol法提取 RNA。

1.6 RT-PCR

將提取的 RNA使用reverse transcriptase (fermentas, hanover, MD, USA) 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。25 μL反應(yīng)體系包括：cDNA模板 1 μL，0.5 μmol/L的正向與反向引物各0.5 μL，Mix 12.5 μL，滅菌水10.5 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，共34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸 10 min，見(jiàn)表1；GAPDH 用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)的內(nèi)對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甲基化特異性PCR結(jié)果和HPV16、HPV18的感染情況

40例子宮頸正常組織有3例甲基化，而40例子宮頸癌組織有31例甲基化(Plt;0.01)。相應(yīng)的分別有5例和27例發(fā)生了hr-HPV的感染，其中包含了27例HPV16,1例HPV18和4例混合感染(Plt;0.01)(表2，圖1)。

表1 引物信息和PCR反應(yīng)條件Table 1 Primer nucleotide sequences and conditions for PCR analysis

F.forward primer; R.reverse primer; M.methylated-specific primers; U.unmethylated-specific primers.

表2 在子宮頸癌和正常組織中，IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化和hr-HPV感染發(fā)生的頻率

Fisher exact test: IFITM1,Plt;0.01;χ2test:hr-HPV,χ2=25.208,Plt;0.01.

M.marker (100～600 bp); m: methylated specific PCR products; u.unmethylated specific PCR products; 1～3.normal tissues; 4～6.cervical cancer tissues圖1 IFITM1甲基化特異性PCR和Hr-HPV特異性PCR結(jié)果Fig 1 Methylation analysis of IFITM1 and Hr-HPV specific PCR results

2.2 半定量RT-PCR結(jié)果

10例IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化的組織中mRNA的表達(dá)量遠(yuǎn)低于10例未甲基化的組織，甲基化陰性標(biāo)本中，平均吸光度值為0.744±0.256；甲基化陽(yáng)性標(biāo)本中,平均吸光度值為0.043±0.007 (Plt;0.01)(n=3)(圖2)。

M.maker(100～600 bp); GAPDH served as an internal control；1～5.samples with hypermethylated IFITM1; 6～10.samples without methylation of IFITM1圖2 IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性和陰性子宮頸組織的mRNA表達(dá)情況Fig 2 IFITM1 gene mRNA expression in cervical tissues without methylation of IFITM1 and cervical tissues with hypermethylated IFITM1

2.3 IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化與HPV16、HPV18感染的關(guān)系

在40例子宮頸癌中，27例HPV陽(yáng)性的樣本中，基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率高于13例HPV陰性的樣本(Plt;0.05)(表3)。

表3 IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化在40例hr-HPV陽(yáng)性和陰性的癌癥樣本中的分布

*Plt;0.05 compared with hr-HPV negative group.

3 討論

子宮頸癌與hr-HPV的感染高度相關(guān)，hr-HPV的檢測(cè)已應(yīng)用于早期大規(guī)模篩查，但是較低的特異性尤其對(duì)于年輕女性影響了子宮頸癌早期篩查的效果，而本研究發(fā)現(xiàn)IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化在檢測(cè)子宮頸癌中表現(xiàn)出了較高的特異性和敏感性，且在40例子宮頸癌患者樣本中，hr-HPV陽(yáng)性的樣本的IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化率高于hr-HPV陰性的樣本,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明，新疆維吾爾族婦女子宮頸癌中IFITM1基因很有可能是子宮頸癌特異的抑癌基因，其啟動(dòng)子甲基化可能是hr-HPV 誘導(dǎo)子宮頸癌的一個(gè)關(guān)鍵分子標(biāo)志和相關(guān)機(jī)制。由于抑癌基因啟動(dòng)子甲基化被證明是腫瘤發(fā)生的早期事件[6]，這將為IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)應(yīng)用于子宮頸癌的篩查和早期診斷的可行性提供分子水平支持。另外，甲基化陽(yáng)性標(biāo)本的mRNA表達(dá)水平比甲基化陰性標(biāo)本的明顯降低甚至缺失，表明IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化抑制了該基因的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明IFITM1基因是子宮頸癌的抑癌基因，可能為臨床檢測(cè)和治療提供新的靶點(diǎn)。

雖然有報(bào)道，IFITM1基因在結(jié)腸癌，胃癌和頭頸部鱗癌等中高表達(dá)[7]，但在胃癌中發(fā)生IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化的標(biāo)本表達(dá)水平降低。同時(shí)IFITM1基因被確認(rèn)為在干擾素-γ誘導(dǎo)的抗腫瘤增生中起關(guān)鍵作用，由于結(jié)腸癌，胃癌上皮細(xì)胞具有活性的β-catenin(一類細(xì)胞骨架蛋白),其異常聚集會(huì)激活下游Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，分化以及腫瘤并發(fā)揮重要作用，此時(shí)，抗腫瘤增生的IFITM1表達(dá)水平便迅速升高，尤其是在早期和晚期[8]。研究證實(shí)，Wnt/β-catenin 抑制相應(yīng)細(xì)胞的分化，進(jìn)而引發(fā)腫瘤[9]，而對(duì)于不表達(dá)β-catenin腫瘤的IFITM1表達(dá)水平升高的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

由上述分析，IFITM1基因啟動(dòng)子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌相關(guān)，其與hr-HPV感染的相關(guān)性使其具有補(bǔ)充和改進(jìn)當(dāng)前以細(xì)胞形態(tài)學(xué)和HPV檢測(cè)為主的早期篩查方法，具有作為早期大規(guī)模篩查的分子標(biāo)志物的價(jià)值。為進(jìn)一步了解該基因在子宮頸癌早期癌前病變中的甲基化特點(diǎn)，需要在高危性上皮內(nèi)瘤變中分析其甲基化水平并做前瞻性的研究，為IFITM1基因作為新靶點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模人群篩查的臨床檢測(cè)和治療提供進(jìn)一步的理論支持。

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Relationship between the promoter methylation ofIFITM1 gene and cervical cancer in Xinjiang Uigur women

ZUO Qiang-qiang, ZHENG Wei-nan, ZHANG Jin-li, LI Yu-hua, LIU Yin-yin, LONG Hai-chen, PAN Ze-min*

(1.Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases of Education Ministry ,Dept. of Biochemistry, School of Medicine,Shihezi University, Shihezi 832002；2.Dept. of Pathology, the First People Hospital of Kashi, Kashi 844000, China)

ObjectiveTo explore the relationship between the gene promoter methylation ofIFITM1 gene and cervical cancer of Xinjiang Uigur women.MethodsMethylation specific PCR (MSP) and HPV16, HPV18 specific PCR were used to analyze 40 normal lervical tissues and 40 cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women. The relationship between the methylation and infection was also investigated in 40 cervical cancer tissues. RT-PCR was used to analyzeIFITM1 gene mRNA expression in 10 methylation positive and 10 methylation negative cervical tissues.ResultsThe methylation frequency ofIFITM1 was 31/40 in cervical cancer, however, it was only 3/40 in normal cervical tissues. The corresponding infection frequency of HPV16 and HPV18 (High-risk HPV, hr-HPV)is 27/40 and 5/40.IFITM1 gene showed a higher methylation frequency in hr-HPV positive cervix as compared with the hr-HPV negative cervix (Plt;0.05). TheIFITM1 gene mRNA expression level decreased in 10 methylation po-sitive cervical tissues than in 10 methylation negative cervical tissues(Plt;0.01).ConclusionsThe hypermethylatedIFITM1 may be a critical marker of cervical cancer that was related to the hr-HPV and is potential for the early cervical cancer screening.

IFITM1 gene; gene promoter methylation; HPV; cervical cancer

2013-08-13

2013-10-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(30860302,30660193)；教育部促進(jìn)與美大地區(qū)科研合作與高層次人才培養(yǎng)項(xiàng)目[教外司美(2011)1056號(hào)]；兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金(2012CB018)；兵團(tuán)國(guó)際科技合作計(jì)劃(2013BC003);科技部國(guó)際合作與交流專題項(xiàng)目(2010DFB34100)

*通信作者(correspondingauthor)： panzemin89@126.com

1001-6325(2014)01-0058-04

R 711.74

A