劉 斌，劉 力

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 病原生物學(xué)系，北京 100005)

NOK癌基因?qū)θ伺吣I293T細(xì)胞周期G1/S期的影響及其作用機(jī)制

劉 斌，劉 力*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 病原生物學(xué)系，北京 100005)

目的探討NOK癌基因?qū)θ伺吣I293T細(xì)胞周期G1/S期的影響，并研究NOK對G1/S期調(diào)控的作用機(jī)制。方法用流式細(xì)胞儀對瞬時轉(zhuǎn)染NOK及pcDNA3.0空載體的293T、293ET及HeLa細(xì)胞進(jìn)行周期檢測，并用免疫印跡法(Western blot)在293T細(xì)胞中，對其細(xì)胞周期G1/S期檢驗點調(diào)控蛋白cyclin D/E1及CDK2/4等蛋白水平進(jìn)行檢測。結(jié)果瞬時轉(zhuǎn)染NOK可使293T、293ET及HeLa細(xì)胞G1期較轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0的細(xì)胞比例減少，S期比例增多 (Plt;0.05)。轉(zhuǎn)染NOK可使G1/S期檢驗點相關(guān)蛋白cyclin D、cyclin E1、p-CDK-2、p-CDK-4、p-Akt及p-Rb蛋白的表達(dá)量上升，使P21及P53蛋白表達(dá)量下降。結(jié)論NOK可促進(jìn)細(xì)胞快速通過細(xì)胞G1/S期檢測點，其機(jī)制涉及對Akt及CDK2/4通路的影響。

NOK；細(xì)胞周期；周期素

細(xì)胞周期是細(xì)胞重要的生理過程，而細(xì)胞周期異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。惡性腫瘤的特征之一在于細(xì)胞周期穩(wěn)態(tài)的失控，所以，對于細(xì)胞周期的研究對了解腫瘤細(xì)胞的增殖與分化有重要作用[1]。NOK(novel oncogene with kinase-domain)是從人扁桃體癌中克隆出的一個新型癌基因，之前的研究已經(jīng)證明，NOK具有腫瘤基因的特征，其可以促進(jìn)BaF3細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)端器官侵襲和轉(zhuǎn)移，且這種致癌效果可在多種組織臟器中發(fā)揮作用[2]，在乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤中均有體現(xiàn)[3]。然而，對于NOK在調(diào)控細(xì)胞周期中的作用機(jī)制尚未見報道。本研究就NOK對于細(xì)胞周期的影響進(jìn)行了一些初步的研究，以期為進(jìn)一步揭示NOK的致癌性作用機(jī)制以及為抗NOK藥物篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將293T，293ET及HeLa細(xì)胞置于10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，待其貼壁增殖至80%～90%匯合時，更換培養(yǎng)液。換液后1 h，使用高效真核轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)入pcDNA3.0(5、4及0 μg)和pcDNA-NOK-HA(或簡稱NOK-HA) (5、1及0 μg)。轉(zhuǎn)染后2 h更換培養(yǎng)基，48 h收獲細(xì)胞。

1.2 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期

取大約3×106個收獲的細(xì)胞置于1.5 mL離心管，5 000r/min離心5 min，棄去上清后用4 ℃ PBS洗滌兩遍，棄去上清。加入0.3 mL 4 ℃ PBS重懸沉淀，后用4 ℃無水乙醇逐滴加入，并輕輕振動，使之成為單細(xì)胞懸液。將離心管置于-20 ℃冰箱內(nèi)進(jìn)行沉淀，24 h后取出離心管，5 000r/min離心5 min去乙醇，使用4 ℃ PBS洗滌兩遍，并重懸，加入1 μL RNase A，放入37 ℃孵箱水浴0.5 h，通過冰浴終止反應(yīng)。加入100 μL PI染色液避光染色10 min后，使用COULTER 流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。本研究中，所有流式檢測設(shè)平行試驗3組，探討NOK對細(xì)胞周期的影響。

1.3 Western bolt檢測蛋白表達(dá)水平

取收獲細(xì)胞于1.5 mL離心管中，12 000r/min離心8 min，棄去上清后用4 ℃ PBS洗滌兩遍，棄去上清。加入0.2 mL細(xì)胞裂解液重懸，冰浴20 min裂解細(xì)胞，后12 000r/min離心10 min，取上清進(jìn)行Western blot檢測。使用Quantity One進(jìn)行吸光度比值測定。

1.4 實驗材料

實驗所用細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心提供)，轉(zhuǎn)染試劑(Vigorous公司)，RNase A(Sigma公司)，細(xì)胞裂解液(北京賽馳生物科技有限公司)，抗體(Bioworld公司)。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1NOK促進(jìn)293T、293ET及HeLa細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期

轉(zhuǎn)染pcDNA3.0的293T細(xì)胞(圖1A)G1期所占比例為(49.10±1.23)%，S期所占比例為(50.75±1.08)%，而轉(zhuǎn)染了NOK-HA的293T細(xì)胞(圖1B)G1期所占比例為(41.51±0.12)%，S期所占比例為(58.49±0.12)%，A組細(xì)胞G1期比例大于B組，S期比例小于B組 (Plt;0.05)。同時，在293ET(圖2)及HeLa(圖3)細(xì)胞中也分別進(jìn)行了同樣的實驗。與轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果一致，在293ET和HeL細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了pcDNA3.0的A組細(xì)胞G1期比例大于轉(zhuǎn)染了NOK-HA的B組細(xì)胞，而S期比例則小于B組細(xì)胞 (Plt;0.05)。

2.2 NOK對cyclin-CDKs蛋白的影響

293T細(xì)胞中，隨著NOK轉(zhuǎn)染量的上升，細(xì)胞周期素D1及與之復(fù)合的p-CDK4蛋白表達(dá)量上升(圖4A)，細(xì)胞cyclin E及與之復(fù)合的p-CDK2蛋白表達(dá)量亦上升(圖4B)。

2.3 NOK對細(xì)胞Akt通路的影響

過表達(dá)NOK可以促進(jìn)CDK上游增殖信號Akt通路的活化，促進(jìn)p-Akt蛋白水平量的上升，且顯著抑制CDK抑制因子P21蛋白的表達(dá)，以及抑制抑癌基因P53的表達(dá)(圖5A)。此外，過表達(dá)NOK可顯著提高CDK下游基因Rb蛋白的磷酸化水平(圖5B)。

A.FCM result of 5 mg pcDNA 3.0 transient transfection in a 35 mm dish; B.FCM result of 5 mg NOK-HA transient transfection in a 35mm dish; C.statistics result of the G1/S distribution of 293T cell;*Plt;0.01 compared with pcDNA 3.0

A.FCM result of 5 mg pcDNA 3.0 transient transfection in a 35 mm dish; B.FCM result of 5 mg NOK-HA transient transfection in a 35 mm dish; C.statistics result of the G1/S distribution of 293ET cell;*Plt;0.05 compared with pcDNA 3.0

A.FCM result of 5 mg pcDNA 3.0 transient transfection in a 35 mm dish; B.FCM result of 5 mg NOK-HA transient transfection in a 35 mm dish; C.statistics result of the G1/S distribution of HeLa cell;*Plt;0.01 compared with pcDNA3.0

圖4 NOK對細(xì)胞Cyclin-CDKs蛋白的變化水平Fig 4 The protein levels change of cyclin-CDKs in responding to increased doses of NOK

A.alterations of upstream proteins of CDKs in responding toNOKover-expression; B.changes of downstream protein of CDKs in responding toNOKover-expression

圖5NOK對CDK上游及下游相關(guān)調(diào)控基因的影響
Fig5TheeffectsofNOKontheexpressionsofupstreamordownstreamregulatorygenesofCDKs

3 討論

NOK是一個受體型蛋白酪氨酸激酶分子(RPTKs)，而RPTKs在細(xì)胞的不同階段都發(fā)揮著重要作用[4]，之前的研究已經(jīng)證明了NOK具有與FGFR/EGFR的高度同源性，且已經(jīng)證明其具有一定的致癌性。但由于NOK缺少胞外配體結(jié)合區(qū)域，所以對于胞外信號受NOK調(diào)控的機(jī)制尚不清晰[5]。過度增殖是腫瘤細(xì)胞的特征之一，而細(xì)胞周期的改變是造成細(xì)胞增殖的重要原因。在本研究中，過表達(dá)NOK基因，可以使細(xì)胞停留在G1期的百分比下降，停留在S期的百分比上升，這提示NOK基因可能具有使細(xì)胞快速從G1期向S期轉(zhuǎn)化的作用，進(jìn)而使細(xì)胞周期縮短，提高細(xì)胞增殖率。

在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期的各個時點存在著起到關(guān)鍵作用的調(diào)控點，發(fā)揮著“開關(guān)”式的作用。這其中細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)因子起到了核心作用，CDK因子主要是依賴于細(xì)胞周期素(cyclins)發(fā)揮特異性調(diào)控作用[6]。具體到細(xì)胞G1/S期調(diào)控，已有大量研究證明，cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2是構(gòu)成細(xì)胞G1/S期檢測點的重要部分，其共同激活Rb蛋白，使其磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入S期[7]。本研究中，293T、293ET及HeLa細(xì)胞流式結(jié)果趨勢基本一致，故本研究只選用了293T細(xì)胞作為蛋白水平檢測細(xì)胞系。在本研究中，在293T細(xì)胞中，過表達(dá)NOK可以使cyclinD1及cyclinE表達(dá)量上升，且可促進(jìn)CDK2和CDK4的磷酸化，提示NOK可能促進(jìn)細(xì)胞cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2復(fù)合物的形成，同時，過表達(dá)NOK使磷酸化Rb蛋白表達(dá)量上升(圖5B)，也提示了NOK可能通過調(diào)節(jié)G1/S期檢測點關(guān)鍵蛋白的方式，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變。上述結(jié)果證明并解釋了流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果。

Akt蛋白的活性與細(xì)胞周期有密切關(guān)系[8-9]，在本研究中，探討NOK對于細(xì)胞G1/S檢測點關(guān)鍵蛋白發(fā)揮作用的機(jī)制，對于其相關(guān)的信號通路進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果顯示，過表達(dá)NOK可以促進(jìn)磷酸化Akt蛋白(p-Akt)的表達(dá)，進(jìn)而起到激活A(yù)kt信號通路的作用，同時，處于Akt信號通路下游的P21及P53因子表達(dá)水平有所降低(圖5A)，而P21與P53分子已被證明可以作用于細(xì)胞G1/S期檢測點，其表達(dá)量上升有抑制CDK蛋白磷酸化的作用，使細(xì)胞停留在G1期[10]。由此本研究認(rèn)為，NOK可能通過影響Akt信號通路的活性，降低P21及P53因子的表達(dá)水平，進(jìn)而提高CDK因子的磷酸化水平，促進(jìn)cyclins-CDKs復(fù)合物的形成，致使Rb蛋白磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，激活E2F/DP，促進(jìn)DNA聚合酶等的轉(zhuǎn)錄過程，使細(xì)胞更快速的通過G1/S期檢測點，由G1期進(jìn)入S期，從而縮短了細(xì)胞周期。

盡管本研究已對NOK對于細(xì)胞周期的影響及其可能涉及到的信號通路做了初步研究，但NO對于細(xì)胞周期發(fā)揮作用的完整機(jī)制尚不清晰，且對于NOK基因在何位置介入到細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也不明確，相關(guān)工作將在后續(xù)研究中予以證明。

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Influence and mechanism ofNOKoncogene on G1/S distribution in human embryonic kidney 293T cells

LIU Bin, LIU Li*

(Dept. of Microbiology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, School of Basic Medicine, PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo analyze the influence of theNOKoncogene on the G1/S distribution in 293T cells and to elucidate the regulated mechanisms responsible forNOKmediated G1/S phase control.MethodsAfter transiently transfectingNOKinto 293T, 293ET and HeLa cells, we detected the cell cycle distribution by flow cytometry. Then, we detected the protein expressions of G1/S check point related genes such as cyclin D, cyclin E1,CDK2 and CDK4 by western blot analysis.ResultsIn the 293T,293ET and HeLa cell which was transfected byNOK, the G1phase proportions of cells were reduced, but the S phase proportion of cells was increased (Plt;0.05). Significant up-regulations in the expressions of cyclin D,cyclin E1, p-CDK-2, p-CDK-4, p-Akt and p-Rb were observed with the increased delivery ofNOKinto 293ET cells.ConclusionsNOKcan promote cell cycle progression by rapidly passing the G1/S check point, which may involve the activation of both Akt and CDK2/4 signaling pathways.

NOK; cell cycle; cyclin

2013-12-23

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金(30871283,81171944)

*通信作者(correspondingauthor)： lliu@pumc.edu.cn

1001-6325(2014)04-0470-05

研究論文

R 113

A