梁振偉，饒書權(quán)，沈 巖，許 琪

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除人源PDE10A基因

梁振偉，饒書權(quán)，沈 巖，許 琪*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

目的建立敲除基因組中PDE10A基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。方法設(shè)計3個長20bp的sgRNA，分別靶向PDE10A的exon 6、exon 7和exon 11?；瘜W(xué)合成sgRNA寡核苷酸序列，并克隆進PX330質(zhì)粒中。將克隆正確的質(zhì)粒PX330-sgRNA轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，提取基因組DNA并對敲除位點附近的DNA片段進行PCR擴增，再通過SURVEYOR分析和一代測序?qū)η贸蔬M行檢測。最后采用有限稀釋法挑選穩(wěn)定敲除PDE10A的HEK 293T細胞株。結(jié)果目的sgRNA 寡核苷酸雙鏈成功插入PX330質(zhì)粒中且序列正確；靶向Exon 7的sgRNA可成功敲除PDE10A，且敲除效率高達31.4%；穩(wěn)定敲除PDE10A的細胞株篩選成功，可導(dǎo)致2 bp 缺失。結(jié)論PDE10A基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)構(gòu)建成功。

PDE10A；CRISPR/Cas9；穩(wěn)定細胞株

PDE10A基因編碼一種屬于環(huán)核苷酸磷酸二酯酶家族的蛋白[1]，通過水解cAMP和cGMP的5′磷酸基團，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)核苷酸的濃度，從而在細胞信號傳導(dǎo)中起重要作用。PDE10A主要分布于新紋狀體中具有多巴胺神經(jīng)元活性的中間棘神經(jīng)元[2]，在腦內(nèi)其他組織如海馬、皮質(zhì)及小腦等也有少量表達[3]。PDE10A表達量異常升高與多種涉及基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)傳遞的神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)，如精神分裂癥、強迫癥和亨廷頓氏舞蹈病等。當使用PDE10A的抑制因子時，可以在小鼠和恒河猴中產(chǎn)生類似抗精神病藥物的效應(yīng)，改善動物的認知功能[4]。本研究利用CRISPR/Cas9建立PDE10A基因靶向敲除系統(tǒng)，為研究PDE10A基因的功能和基因敲除干細胞或小鼠提供一部分研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK 293T細胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心)，PX330質(zhì)粒，DH5a感受態(tài)(Transgene公司)，限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和T4連接酶(NEB公司)，質(zhì)粒小提試劑盒，2×PCR mix(天根生化科技有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo公司)，NeoFect DNA轉(zhuǎn)染試劑(零客創(chuàng)智有限公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(康為世紀公司)，F(xiàn)lexiGene Kit(Qiagen公司)，SURVEYOR分析試劑盒(Transgenomic公司)。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈合成：應(yīng)用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站設(shè)計PDE10Aguide RNA。設(shè)計標準如下：1)長20 nt的寡核苷酸sgRNA核心序列按G(N)20NGG序列進行設(shè)計；2)正義鏈模板的5′端添加CACC，與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補；反義鏈模板的5′端添加AAAC，與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補。寡核苷酸序列(表1)。設(shè)計CRISPR 鑒定引物：1)PDE10A-Exon 7：F：5′-GATA GAAATAAGAATCATCAC-3′，R：5′-TCTCCAAAGTC CTTCTACTAC-3′，切割后，上游191 bp，下游328 bp；2)PDE10A-Exon 6：F：5′-GTGAAGTGGAAATGTGA GATAG-3′，R：5′-TGTTAGTGGGTAAAG GGAA-3′，切割后，上游190 bp，下游325 bp； 3)PDE10A-Exon 11：F：5′-CTAATCAGAATGAGTGGTGGTCG-3′，R：5′-CA CAGAAAAATGGGTAACGGA-3′，切割后,上游474 bp，下游177 bp。所有寡核苷酸鏈和引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.2 PX330-sgRNA載體構(gòu)建：將sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈：取等量的上游鏈和下游鏈混合(終濃度為50 μmol/L)。程序如下：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min，-1 ℃ /循環(huán)，22個循環(huán)；72 ℃，30 min；71 ℃，1 min，-1 ℃/循環(huán)，46個循環(huán)；4 ℃保持。將sgRNA寡核苷酸雙鏈稀釋至0.5 μmol/L。用BbsⅠ內(nèi)切酶線性化PX330質(zhì)粒，切膠回收后稀釋至50 g/L。連接體系：線性化PX330質(zhì)粒，50 ng；0.5 μmol/L sgRNA寡核苷酸雙鏈，1 μL；10×T4 DNA連接酶緩沖液，1.5 μL；牛血清白蛋白(10 g/L)：0.5 μL；加水至15 μL，16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取單克隆，小提質(zhì)粒并測序驗證(由諾賽基因公司完成)。

1.2.3 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染：HEK293T細胞培養(yǎng)條件：高糖-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前24 h，將HEK293T細胞以5×105/孔接種至6孔板中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到60 %～70 %。轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)基，采用NeoFect轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染。等量pEGFP-N1質(zhì)粒作為陰性對照。

1.2.4 細胞基因組DNA提?。恨D(zhuǎn)染48 h后，將各組細胞消化收集，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，采用FlexiGene Kit試劑盒提取基因組DNA[5]。

1.2.5 PCR，SURVEYOR分析以及一代測序鑒定：PCR條件如下：20 μL PCR體系：2×PCR Mix：10 μL；ddH2O：8 μL；基因組DNA：1 μL(50 ng)；10 μmol/L Primer(上游和下游)各0.5 μL，共20 μL。PCR程序為：94 ℃ 5 min，35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)，4 ℃保持。取2 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(濃度1%)檢測。對sgRNA靶點附近的基因組DNA擴增后進行正向測序，若sgRNA位點以后的區(qū)域出現(xiàn)低矮的套峰，說明基因敲除成功。

SURVEYOR分析按如下步驟進行：用1 %瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行切膠純化。將回收產(chǎn)物稀釋至50 g/L，取20 μL回收產(chǎn)物按照SURVEYOR分析試劑盒操作步驟進行[6]檢測，用2 %瓊脂糖凝膠進行分析。隨后，進行吸光度分析，計算公式為：indel (%)=100×[1-(1-fcut)1/2]，fcut=(b+c)/(a+b+c)，其中a表示未被切割條帶的吸光度值，b和c分別表示切割產(chǎn)生新條帶的吸光度值，indel為插入缺失率，fcut為切割比率。

1.2.6 篩選PDE10A穩(wěn)定敲除細胞株：將PX330-sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞48 h后，采用有限稀釋法，將單細胞種至96孔板中。操作步驟如下：胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)，采用梯度稀釋法稀釋至每100 μL培養(yǎng)基0.5個細胞，按每孔100 μL細胞稀釋液加至96孔板中。待細胞生長至96孔板底1/2時，取少量細胞提取DNA，經(jīng)PCR擴增后測序，測序結(jié)果與原基因組DNA進行對比，檢測是否靶向PDE10A成功[7]。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA靶點以及寡核苷酸序列設(shè)計

PX330質(zhì)粒信息(圖1A)；以Exon 7 sgRNA為例，其插入位置和序列信息(圖1B)。sgRNA靶點以及寡核苷酸序列(表1)。

A.the structure of plasmid PX330, which has twoBbsⅠ restriction sites in the target sites; B.the genome locus of Exon 7 sgRNA

圖1 PX330載體構(gòu)建示意圖Fig 1 The establishment of plasmid PX330

2.2 PX330-sgRNA質(zhì)粒的測序結(jié)果

插入序列的位置、方向及序列與預(yù)期相符，證明質(zhì)粒構(gòu)建完全正確(圖2)。

2.3SURVEYOR分析對sgRNA靶向敲除效果進行檢測

只有Exon 7 sgRNA靶向敲除成功(圖3)。

2.4 利用一代測序?qū)Π邢蚯贸ЧM一步檢測

Exon 7 sgRNA 靶點附近的基因組DNA的一代測序(圖4)。

2.5 建立穩(wěn)定敲除PDE10A的293T細胞株

單克隆細胞測序后與原基因組DNA進行對比結(jié)果(圖5)。

3 討論

傳統(tǒng)基因敲除，主要是應(yīng)用同源重組原理通過插入突變和基因靶向技術(shù)使目的基因的功能喪失[8]。而CRISPR/Cas系統(tǒng)，利用與目的基因具有同源性的sgRNA能夠特異性結(jié)合基因組DNA上，形成雜合雙鏈，而特定的核酸內(nèi)切酶Cas9能夠?qū)υ撾s合雙鏈進行切割造成DNA的雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSB)。DSB誘導(dǎo)產(chǎn)生位點特異性的核酸酶，通過錯誤傾向的非同源末端連接 (non-homologous end joining, NHEJ)對切斷的雙鏈進行修復(fù)，這種修復(fù)將在斷裂位點產(chǎn)生插入或者缺失。所以與特定位點同源的sgRNA以及Cas9是進行基因敲除不可缺少的兩個元件。該系統(tǒng)具有快速、可靠、特異性高以及敲除效率高等特點[9]。

The nucleotides in italic represented sgRNA sequences圖2 插入DNA序列測序圖Fig 2 Sequences of the inserts

The marker is D2000 and the GFP was used as negative control圖3 SURVEYOR 檢測Exon 7 sgRNA的靶向敲除效果Fig 3 SURVEYOR assay of Exon 7 sgRNA targeted knockout effect

本研究構(gòu)建的PX330-PDE10A-Exon 7-sgRNA質(zhì)粒攜帶有化膿性鏈球菌型Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas9核酸內(nèi)切酶基因，在轉(zhuǎn)染進細胞后可以表達該核酸內(nèi)切酶。通過SURVEYOR分析試劑盒進行產(chǎn)物多態(tài)性分析和特定位點的切割效率檢測，發(fā)現(xiàn)PX330-PDE10A-Exon 7-sgRNA的轉(zhuǎn)染在PDE10A基因目的位點產(chǎn)生切割的效率高達31.4%。通過一代測序，可以發(fā)現(xiàn)在特定位點存在大量的套峰結(jié)構(gòu)，這進一步證實了SURVEYOR分析的結(jié)果。在28個細胞亞克隆中，有3個克隆在目的片段中出現(xiàn)了堿基的缺失突變，其中3 bp和6 bp缺失對PDE10A編碼的蛋白序列影響較小，選取缺失2 bp的細胞株進行擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定敲除PDE10A的細胞株。這進一步證明該系統(tǒng)對PDE10A基因的敲除是有效的。

由于PDE10A蛋白主要調(diào)節(jié)細胞中cAMP的濃度，而cAMP是細胞內(nèi)重要的第二信使分子，在許多細胞信號通路中存在影響。因此，PDE10A基因在多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的病理學(xué)發(fā)生途徑中具有重要作用[10]。本研究構(gòu)建PDE10A基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，將為后續(xù)構(gòu)建PDE10A敲除干細胞和敲除小鼠提供實驗依據(jù)。

As is noted that the cleavage site was located just 3bp before the PAM motif圖4 一代測序驗證Exon 7 sgRNA靶向敲除效果Fig 4 The sequences of the Exon 7 sgRNA target site

圖5 3個單克隆細胞在目的sgRNA位點的缺失突變Fig 5 The deleted mutation of the three monoclonal cells at the sgRNA sites

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Knocking out humanPDE10Agene by CRISPR/Cas9 system

LIANG Zhen-wei, RAO Shu-quan, SHEN Yan, XU Qi*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo construct the CRISPR/Cas9 system constructed by knocking out thePDE10Agene.MethodsThree 20 bp sgRNAs targeting exon 6, exon 7 and exon 11 ofPDE10Awere designed, chemically synthesized, and then inserted into linearized plasmid, PX330. Next, the correct PX330-sgRNA plasmids were transfected into HEK293T cells after verification by Sanger sequencing. The targeting efficiency was detected by SURVEYOR assay and the nicked site was further detected by Sanger sequencing. Finally, the stablePDE10Aknockout 293T cell line was selected by the limiting dilution method.ResultsThe target nucleotide sequences were successfully inserted into the expected sites of vector and sequences were correct. The targeted exon 7 sgRNA can successfully knockPDE10A, and the targeting efficiency was up to 31.4 %. Stable knockoutPDE10Acell line was selected successfully which harbored 2 bp deletion.ConclusionsThe CRISPR/Cas9 system constructed by knocking out thePDE10Agene is successfully constructed.

PDE10A; CRISPR/Cas9 system; Stable cell lines

2013-12-19

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金(31222031)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(2012S05)；協(xié)和青年科研基金(2012J09)；新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-12-0071)

*通信作者(correspondingauthor)： xuqi@pumc.edu.cn

1001-6325(2014)04-0439-05

研究論文

R 34

A