王建升 帖彥清 張立志 呂元鵬 宋津曉(河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊050051)

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤的第二位，超過(guò)50%的結(jié)直腸癌患者最終死于腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的并發(fā)癥［1］。近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率在逐年上升，在大城市尤為顯著［2］。因此，結(jié)直腸癌已成為我國(guó)城鄉(xiāng)居民生命安全的主要威脅。

Tc17細(xì)胞是一類由初始CD8+T細(xì)胞分化而來(lái)的效應(yīng)T細(xì)胞，能特異性的產(chǎn)生IL-17，具有不同于Tc1 型和 Tc2 型細(xì)胞的分化、發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制［3，4］。Tc17細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)，并參與腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等的發(fā)生和發(fā)展，是近年來(lái)免疫學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)［5］。但目前對(duì)于Tc17細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子在結(jié)直腸癌進(jìn)展中究竟是如何變化的，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。

在本研究中，我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血中Tc17細(xì)胞比例的變化;用ELISA法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血中IL-1β、IL-17A、IL-6和IL-23水平的變化;為確定這些細(xì)胞因子水平的變化是造成Tc17細(xì)胞數(shù)量變化的主因，我們用淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)觀察不同濃度的 IL-1β、IL-6和 TGF-β對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中Tc17細(xì)胞分化誘導(dǎo)的影響，以闡明結(jié)直腸癌患者外周血中影響Tc17細(xì)胞擴(kuò)增的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本來(lái)源于河北省人民醫(yī)院2010年6月至2012年12月結(jié)直腸腺癌患者(結(jié)腸腺癌26例，直腸腺癌28例)，男27例、女27例，年齡43～86歲，平均65歲。所有患者的血標(biāo)本收集前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)且確定其病理分型、臨床分期。根據(jù)AJCC頒布的結(jié)、直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)將54例結(jié)直腸腺癌患者按臨床病理分期分為兩組:早期結(jié)直腸腺癌組(Ⅰ、Ⅱ)25例;晚期結(jié)直腸腺癌組(Ⅲ、Ⅳ)29例。健康志愿者17例，男9例、女8例，年齡44～83歲，平均65歲。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，并報(bào)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 Ficoll-Hypaque分離液購(gòu)自Sigma公司;重組IL-1β、IL-6和TGF-β購(gòu)自PeproTech公司;佛波酯、離子霉素、布雷菲得菌素A、FIX＆PERM Kit Reagent、抗人 CD3、CD28、CD8、IL-17A 及其相應(yīng)的同型對(duì)照、IL-1β、IL-6、IL-17A 和 IL-23 ELISA 試劑盒均購(gòu)自eBioscience公司。

1.3 標(biāo)本收集 所有受試對(duì)象于清晨抽取空腹外周血，其中4 ml置入肝素鈉抗凝管內(nèi)，淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque液)分離外周血PBMCs用于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè);5 ml外周血離心后取血清儲(chǔ)存于－80℃以備分析細(xì)胞因子用。

1.4 Tc17細(xì)胞流式檢測(cè) 分離的PBMCs以1×106ml/孔鋪于48孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 μg/ml離子霉素和 25 ng/ml佛波酯各 20 μl，然后加入 10 μg/ml布雷菲得菌素 A 20 μl，于5%CO2孵箱37℃孵育5 h。用FITC標(biāo)記的抗人CD8單抗和PE-Cy5標(biāo)記的抗人CD3單抗進(jìn)行細(xì)胞表面分子的染色，通過(guò)Reagent A固定、Reagent B破膜后再用PE標(biāo)記的抗人IL-17A單抗標(biāo)記胞內(nèi)抗體，0.5 ml 1%多聚甲醛PBS重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用CellQuest分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。Tc17細(xì)胞以CD3+CD8+IL-17+T細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中的百分比表示。

1.5 PBMCs體外培養(yǎng) 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔各加50 μl含4 μg/ml抗CD3單克隆抗體的PBS液，置于4℃冰箱16 h后棄液備用。取7例健康志愿者的外周血，用Ficoll-Hypaque分離PBMCs后重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)液中，按1×106細(xì)胞/孔加入96孔板中，每孔 100 μl;每孔加入 2 μg/ml可溶性抗CD28單克隆抗體，再向各孔中加入以下細(xì)胞因子:第一孔為0.5 ng/ml TGF-β;第二孔為5 ng/ml TGF-β;第三孔為50 ng/ml IL-6;第四孔為25 ng/ml IL-6;第五孔為50 ng/ml IL-6和5 ng/ml TGF-β;第六孔為10 ng/ml IL-1β;第七孔為25 ng/ml IL-1β。其中不加任何細(xì)胞因子僅含培養(yǎng)液的孔作為對(duì)照。置于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)84 h。收集細(xì)胞進(jìn)行Tc17細(xì)胞流式檢測(cè)。

1.6 ELISA檢測(cè) 收集所有受試對(duì)象的血清，用雙抗體夾心法進(jìn)行人 IL-1β、IL-17A、IL-6和 IL-23的ELISA檢測(cè)。操作過(guò)程均按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞因子的濃度以pg/ml表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用x－±s表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布(呈偏態(tài)分布)，采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者外周血Tc17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化 晚期結(jié)直腸癌患者外周血中Tc17細(xì)胞比例(P＜0.001)及 IL-17A(P=0.026)、IL-23(P＜0.001)、IL-1β(P=0.001)和 IL-6(P＜0.001)水平都高于健康對(duì)照。早期結(jié)直腸癌患者外周血中的Tc17細(xì)胞的比例明顯高于晚期患者(P＜0.001)。與早期結(jié)直腸癌患者相比，晚期患者外周血中IL-1β(P=0.013)、IL-17A(P=0.001)和 IL-23(P=0.305)水平降低，但 IL-6 水平升高(P=0.009)。見(jiàn)圖1和表1。

2.2 結(jié)直腸癌患者外周血Tc17細(xì)胞與IL-1β、IL-23、IL-6相關(guān)性分析 結(jié)直腸癌患者外周血中的Tc17細(xì)胞與IL-1β、IL-23呈正相關(guān)，但與IL-6無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)圖2。

表1 早、晚期結(jié)直腸腺癌患者和健康對(duì)照外周血中Tc17細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較Tab.1 Proportions of circulating Tc17 cells and serum levels of their related cytokines in patients with early and advanced CRC and healthy controls

圖2 結(jié)直腸癌患者外周血Tc17細(xì)胞與IL-1β、IL-23、IL-6相關(guān)性分析Fig.2 Correlation between Tc17 cells and IL-1β，IL-23 or IL-6 in CRC patients

圖3 不同濃度的 IL-1β、IL-6和 TGF-β對(duì) PBMCs中Tc17細(xì)胞分化誘導(dǎo)的影響Fig.3 Effect of different concentration of IL-1β，IL-6 and TGF-β on proportion of Tc17 cells in PBMCs

2.3 IL-1β、IL-6 和 TGF-β 對(duì) PBMCs中 Tc17 細(xì)胞分化誘導(dǎo)的影響 與對(duì)照相比，低濃度的IL-1β(IL-1βlo，10 ng/ml)能增加了 PBMCs中 Tc17 細(xì)胞的比例(P=0.029);與 IL-1βlo相比，高濃度的 IL-1β(IL-1βhi，25 ng/ml)使 PBMCs中 Tc17 細(xì)胞的比例明顯增多(P=0.009)。盡管高濃度的TGF-β(TGF-βhi，5 ng/ml) 或低濃度的 TGF-β(TGF-βlo，0.5 ng/ml)都能促進(jìn)PBMCs中Tc17細(xì)胞的比例增多，但與對(duì)照相比，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(TGF-βhi，P=0.277;TGF-βlo，P=0.064)。高濃度的 IL-6(IL-6hi，50 ng/ml)和低濃度的IL-6(IL-6lo，25 ng/ml)雖不能增加PBMCs中 Tc17 細(xì)胞的比例(P＞0.05)，但 IL-6hi和TGF-βhi共同作用反而大大增加了 PBMCs中 Tc17細(xì)胞的比例(IL-6hi，P=0.002;TGF-βhi，P=0.002)。見(jiàn)圖3。

3 討論

Tc17細(xì)胞是一類促炎性細(xì)胞，其在感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究頗多，但在腫瘤中的報(bào)道較少。胃癌患者外周血和腫瘤組織中的Tc17細(xì)胞隨著疾病的進(jìn)展而增加，且腫瘤組織中的Tc17細(xì)胞比例明顯高于外周血，高比例的Tc17細(xì)胞與胃癌患者的總生存期和無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，并可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［6］。與健康人外周血相比，鼻咽癌患者外周血中有低比例Tc17細(xì)胞，而瘤組織則存在高比例Tc17細(xì)胞，這是因?yàn)門c17細(xì)胞能高表達(dá)CCR6，而腫瘤組織高表達(dá) CCL20，后者能募集Tc17細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，致使患者外周血中的Tc17細(xì)胞數(shù)量減少［7］。我們的結(jié)果表明，結(jié)直腸癌患者外周血中Tc17細(xì)胞的比例高于健康對(duì)照，但隨著疾病的進(jìn)展，其在結(jié)直腸癌患者外周血中的比例反而減少，其特征是細(xì)胞因子IL-17A也呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)，我們推測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血中的Tc17細(xì)胞隨著腫瘤的發(fā)展也可能被募集到腫瘤組織中，不過(guò)，這一推測(cè)尚待進(jìn)一步證實(shí)。

盡管我們對(duì)Th17細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程有了更深入的了解，但對(duì)Tc17細(xì)胞的分化發(fā)育目前有所爭(zhēng)議。IL-6和TGF-β能誘導(dǎo)鼠初始CD8+T細(xì)胞分化為Tc17細(xì)胞［8］，IL-23是一種更有效地促進(jìn)Tc17細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵細(xì)胞因子［9］。然而，Dwivedi等［10］報(bào)道，TGF-β對(duì)鼠體內(nèi)的Tc17細(xì)胞分化是不需要的，它的存在反而抑制Tc17細(xì)胞的分化。在胃癌和肝癌患者的腫瘤組織中，腫瘤活化的單核細(xì)胞(Tumoractivated monocytes)分泌 IL-1β、IL-6 和 IL-23，這些細(xì)胞因子促進(jìn)了 Tc17細(xì)胞的分化［6，11］。我們的結(jié)果表明，Tc17細(xì)胞的比例和IL-1β、IL-23的水平有一致的變化趨勢(shì)，而與IL-6水平的變化恰好相反。相關(guān)性分析表明，結(jié)直腸癌患者外周血中的Tc17細(xì)胞與IL-1β、IL-23呈正相關(guān)，但與 IL-6無(wú)相關(guān)性。另有研究表明，結(jié)直腸癌患者血清中TGF-β水平隨著疾病的進(jìn)展呈明顯增高［12，13］。由此我們推測(cè)不同濃度的IL-1β、IL-6和TGF-β在誘導(dǎo)Tc17細(xì)胞的分化中可能起著一定的作用。體外試驗(yàn)證實(shí)，IL-1β能誘導(dǎo)PBMCs中Tc17細(xì)胞的分化;雖然TGF-β也能誘導(dǎo)PBMCs中Tc17細(xì)胞的分化，但與對(duì)照相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;盡管IL-6不影響PBMCs中Tc17細(xì)胞的分化，但高濃度的IL-6和高濃度的TGF-β共同作用于PBMCs反而促進(jìn)Tc17細(xì)胞的分化，說(shuō)明TGF-β和IL-6在調(diào)節(jié)Tc17細(xì)胞的分化發(fā)育中確實(shí)起一定的作用。另外，我們的體外試驗(yàn)沒(méi)有選擇IL-23，是因?yàn)镮L-23是一種公認(rèn)的使Tc17細(xì)胞擴(kuò)增和功能維持的重要細(xì)胞因子［5］。

總之，通過(guò)分析Tc17細(xì)胞在結(jié)直腸癌早、晚期的差異，我們發(fā)現(xiàn)Tc17細(xì)胞在疾病早期階段高表達(dá)，而在晚期階段低表達(dá)。通過(guò)對(duì)外周血中與其分化相關(guān)的細(xì)胞因子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Tc17細(xì)胞的變化總是伴隨著 IL-1β、IL-6和 IL-23的變化。體外試驗(yàn)證實(shí)，IL-1β、高濃度的IL-6和高濃度的TGF-β在調(diào)節(jié)Tc17細(xì)胞的分化發(fā)育中起著決定性作用，進(jìn)一步支持了其分化所需要的微環(huán)境?？梢?jiàn)，更好地了解結(jié)直腸癌進(jìn)展中Tc17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化將能大大激勵(lì)更深入對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)展中免疫機(jī)理的研究和探索。

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