朱毅，郭佳寶，李凝，岳雨珊，張文毅，謝斌

生物鐘在細胞的新陳代謝、增殖等過程中起著至關(guān)重要的作用，它們參與一系列的晝夜調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄翻譯的反饋、前饋回路[1]，其特異性核心組成是生物鐘基因及其蛋白產(chǎn)物。生物鐘基因通過直接或間接的方式控制DNA的表達，例如損傷的識別和修復[2]，其蛋白產(chǎn)物也可以通過調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)其表達[3]。

生物鐘基因包括clock、bmal1、per-1,2,3、cry-1,2、reverbα和dec-1,2，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦和脊髓以及周圍各個器官，如腸道、胃、心臟、肝臟、腎臟、胰腺、睪丸、卵巢、骨骼肌、口腔黏膜、皮膚、骨骼和單細胞白血球等[4-5]，不僅參與生物周期節(jié)律的調(diào)節(jié)，還參與器官功能的調(diào)節(jié)，當其突變或者缺失時，會引起節(jié)律系統(tǒng)的紊亂。bmal1/clock家族主要分布于視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)、杏仁核(amygdala)、下丘腦腹側(cè)核(ventromedial hypothalamus,VMH)、嗅球(olfactory bulb,OB)、外側(cè)系帶(lateral habenula)、海馬(hippocampus)和下丘腦(hypothalamus)內(nèi)的一些核團[6-8]，在對內(nèi)臟活動和情緒的調(diào)控中，邊緣系統(tǒng)起到重要作用。per2基因是bmal1/clock家族一個成員，參與一系列的正負反饋環(huán)路，在邊緣系統(tǒng)對情緒和內(nèi)臟活動的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中扮演重要的角色[9]，除了受到SCN調(diào)節(jié)，還接受上級邊緣系統(tǒng)(如終紋床核、杏仁核)和下游皮質(zhì)醇的負反饋調(diào)節(jié)，而其在邊緣系統(tǒng)的作用以及邊緣系統(tǒng)內(nèi)各功能區(qū)之前的聯(lián)系尚不清楚。本文主要針對per2基因形態(tài)學、生物學以及其參與邊緣系統(tǒng)對情緒、內(nèi)臟活動晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)機理做一綜述。

1 per2基因形態(tài)學概述

per2主要是由二聚體PAS-A和PAS-B通過1,4-二巰基蘇糖醇(1,4-dithiothreitol)連接形成PAS-AB二聚體，PAS-AB二聚體和后面的α螺旋體結(jié)構(gòu)(α-helical extension,αF)構(gòu)成per2的中央片段[10]。per2基因首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，隨后根據(jù)同源性分析，在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)表達該基因，小鼠為mper2，人類為hper2，兩者均含有封閉的PAS結(jié)構(gòu)域[11]。人類的per2基因與果蠅和小鼠的per2基因分別具有44%和77%的同源系類[12]。斑馬魚的clock1a、clock1b是哺乳動物clock1的同源基因[13]。果蠅的clock基因具有驚人的序列保守性，與哺乳動物的節(jié)律基因clock有高度的相似性，他們都含有基礎(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)和PAS區(qū)域，以及一個轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域[14]。

per2與CLOCK/BMAL1復合物生物功能密切相關(guān)。bmal1和clock均為堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子的C組家族成員[15]。動物bHLH轉(zhuǎn)錄因子中包含A、B、C、D、E、F 6組共45個家族[10,16]，最早發(fā)現(xiàn)于小鼠體內(nèi)，是最早被確定的哺乳動物鐘基因；bHLH轉(zhuǎn)錄因子幾乎存在于所有的真核生物體內(nèi)，在生長發(fā)育中起到極其重要的調(diào)控作用。clock基因是哺乳動物生物鐘節(jié)律的重要調(diào)控者，在需要時鐘調(diào)控的組織中起著中心作用。見圖1。

圖1 鐘基因在老鼠結(jié)腸上皮的表達[17]

2 per2基因的生物功能

2.1 per2的合成和儲存

由兩個轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白，含有bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域，然后以異二聚體的形式結(jié)合到per2上游的E盒，從而激活per2基因的轉(zhuǎn)錄，其表達產(chǎn)物為PER2。然后per2基因與另外一種鐘蛋白組成異二聚體，發(fā)揮抑制作用。在哺乳動物中，轉(zhuǎn)錄因子CLOCK和BMAL1通過bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域形成異二聚體，二聚化的CLOCK-BMAL1結(jié)合到per1-3和cry1-2上游啟動子的E盒，從而激活基因轉(zhuǎn)錄，進而翻譯產(chǎn)生PER和CRY蛋白。PER蛋白與CRY蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)形成異二聚體，該二聚體入核后通過與CLOCK/BMAL1二聚體結(jié)合，抑制CLOCK/BMAL1二聚體與E盒的結(jié)合，從而呈現(xiàn)生物鐘的負反饋環(huán)路調(diào)節(jié)[18]。

圖2 鐘基因生物節(jié)律反饋路徑[19-22]

2.2 per2的釋放和失活

細胞外信號激活下游的一些蛋白激酶，然后激活胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和細胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)，使PER2蛋白磷酸化，繼而轉(zhuǎn)錄激活因子，從而使其與per2基因的啟動因子結(jié)合，誘導per2的激活[13]。而其失活的主要原因是PER2蛋白磷酸化[23]：PER2蛋白生成后，在胞漿中累積，在酪蛋白激酶的作用下不斷磷酸化，磷酸化狀態(tài)下的PER2蛋白不穩(wěn)定，可被廣泛生物素化而降解[11]。

3 per2參與邊緣系統(tǒng)調(diào)節(jié)對情緒和內(nèi)臟運動的影響

在下丘腦以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，己明確邊緣系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)軸的活動而參與對情緒和內(nèi)臟應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。邊緣系統(tǒng)-下丘腦-垂體-腎上腺(limbic system-HPA,LHPA)軸被稱為是連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)和機體周圍組織的“信息高速公路”[24]。per2參與邊緣系統(tǒng)的晝夜節(jié)律表達。per2基因主要表達在終紋床核(bed nucleusof thestria terminalis,BNST)、中央杏仁核(central nucleus of amygdala,CEA)、海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)、基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygadaloid,BLA)等腦內(nèi)核團[25-26]，且均為應(yīng)激時神經(jīng)內(nèi)分泌參與運動、情感、行為和心理調(diào)節(jié)的重要區(qū)域，提示per2在邊緣系統(tǒng)的作用可能涉及應(yīng)激和藥物濫用相關(guān)的行為和神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，攝食、學習和記憶的調(diào)節(jié)，母性行為和生殖等領(lǐng)域，涉及多個靶器官[19,27]。per2在維持邊緣系統(tǒng)功能的完整性上發(fā)揮重要作用[11]，所以per2也可能通過參與邊緣系統(tǒng)的晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)來參與情緒和腸道活動[28]。見圖3。

圖3 在ZT1或ZT13，per2在大鼠的SCN、BNSTov和CEA的免疫反應(yīng)性

3.1 SCN對per2在邊緣系統(tǒng)作用的同步調(diào)控

生物鐘可分為母鐘和子鐘。哺乳動物的母鐘位于下丘腦前部的SCN，它被認為是主要的晝夜節(jié)律的起搏器，控制著機體行為和生理[31]。在哺乳動物中，光信號能直接啟動生物的節(jié)律。外界環(huán)境的光信號進入眼睛，直接作用于光敏感視黃醇神經(jīng)細胞，通過視網(wǎng)膜下丘腦纖維，最后到達SCN，誘導per2基因的轉(zhuǎn)錄，進而翻譯產(chǎn)生PER2蛋白[13]，在邊緣系統(tǒng)內(nèi)PER2蛋白的節(jié)律表達受到SCN的控制，SCN中的PER2蛋白的節(jié)律能同步調(diào)控在邊緣系統(tǒng)中的PER2蛋白的振蕩器，進而調(diào)控PER2蛋白在邊緣系統(tǒng)作用。在BNST、CEA、BLA和DG 4個區(qū)域內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)了PER2蛋白節(jié)律的表達呈現(xiàn)2個相反的模式，在BNST和CEA上，PER2蛋白表達的最高點大約在白天轉(zhuǎn)變?yōu)橐雇淼倪@個過渡時間段內(nèi)，且他們的節(jié)律與在SCN內(nèi)的PER2節(jié)律同步，相反，在BLA和DG內(nèi)，PER2節(jié)律的峰值在早上，并與SCN、BNST、CEA的節(jié)律相反[11]。

3.2 PER2蛋白參與BNST和CEA的節(jié)律調(diào)節(jié)

Alheid和Heimer提出，終紋床核(bed nucleus of stria terminalis,BST)是杏仁核的延伸部，因為它們與杏仁核有類似的下行投射，還有證據(jù)表明它們由蒼白嵴發(fā)育而成。這兩個結(jié)構(gòu)在神經(jīng)發(fā)生過程中是同一來源，所以結(jié)構(gòu)、功能相似，但是他們參與的通路有些差異[32]。CEA和BNST參與激活HPA軸的應(yīng)激反應(yīng)，下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)是HPA軸活動的直接控制部位，CEA可能直接作用于PVN，也可能通過BNST等中繼核團信息的傳遞來作用于PVN[24]。HPA軸的激活能促進類固醇激素的分泌，而在CEA和BNST上PER2的節(jié)律對這些激素的改變表現(xiàn)敏感。如抑制下丘腦室旁核的腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin releasing factor,CRF)表達，阻礙CRF進入BNST，從而減少PER2蛋白的水平，CRF參與PER2蛋白表達取決于細胞內(nèi)信號而不是直接作用于per2基因的轉(zhuǎn)錄。見圖4。

圖4 CRF和CRF/PER2在BNSTov和CEA的表達

另外，以皮質(zhì)醇(corticosterone,CS)影響為主的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)發(fā)出信號，由在BNST和CEA上的激素受體介導，通過調(diào)節(jié)per2基因在BNST和CEA內(nèi)的表達而產(chǎn)生相應(yīng)生物學效應(yīng)。甲狀腺激素(thyroid hormone)通過調(diào)節(jié)per2基因的轉(zhuǎn)錄來影響PER2蛋白的表達[11]；應(yīng)激負荷時HPA軸分泌釋放的激素可以調(diào)節(jié)消化道的功能，如促甲狀腺激素釋放激素(thyroliberin,TRH)可使小腸及大腸運動亢進，而促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone,CRH)則減低胃的運動但使大腸運動亢進[33]。所以，當外界一個刺激作用于機體時，激活CEA和BNST上的神經(jīng)元，通過興奮HPA軸分泌釋放激素來參與情緒和內(nèi)臟應(yīng)激的調(diào)控。HPA軸分泌的激素又能產(chǎn)生相應(yīng)的反饋作用，調(diào)節(jié)在CEA和BNST上PER2蛋白的表達水平，導致per2基因在CEA和BNST上的節(jié)律受到影響，從而影響CEA和BNST的功能。所以per2基因參與CEA和BNST的節(jié)律調(diào)節(jié)，是情緒和消化道中樞調(diào)控的途徑之一。見圖5。

圖5 生物鐘系統(tǒng)和HPA軸在多個層次活動的相互作用[34]

3.3 PER2蛋白參與BLA和DG的節(jié)律調(diào)節(jié)

作為HPA軸的高位調(diào)節(jié)中樞，大量研究表明海馬能抑制HPA軸的激活[1]。海馬齒狀回是海馬的傳入門戶[35]，當一個外界刺激作用時，神經(jīng)元興奮累計到一定數(shù)量時引起整個DG的興奮，DG和BLA的興奮對HPA軸的激活起到抑制作用，而PER2蛋白在BLA和DG上的節(jié)律表達對BLA和DG的功能產(chǎn)生影響，從而通過影響HPA軸來參與情緒和內(nèi)臟的調(diào)控。

4 PER2和HPA軸對腸道節(jié)律性運動的調(diào)節(jié)及臨床意義

腸道的運動也遵循一定的晝夜節(jié)律，它的運動通常發(fā)生在白天，尤其在醒后，很少發(fā)生的夜間，通過改變生活作息來打破這種正常的腸道節(jié)律會導致一系列的腸道癥狀，這說明腸道運動與生物鐘有關(guān)[35]，而失眠同樣也是鐘基因異常的表現(xiàn)[36-37]。運用免疫組織化學的研究方法，在對神經(jīng)遞質(zhì)合成和腸功能調(diào)節(jié)具有重要作用的腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,CE)、腸肌叢(myenteric plexus,MP)和肌間神經(jīng)叢標本(longitudinal muscle myenteric plexus,LMMP)中發(fā)現(xiàn)了PER2蛋白，說明其在腸道的細胞和神經(jīng)元內(nèi)普遍存在[3]。有研究表明，破壞per1和per2基因后發(fā)現(xiàn)小鼠的腸道運動減弱，而單獨破壞per1和per2基因的老鼠在腸道運動的表達也產(chǎn)生了時間差異[38]，所以per2及其編碼的蛋白參與了腸道的運動，在腸道生理活動上扮演重要的角色[3,19]。

而PVN不僅通過節(jié)律性釋放CRF調(diào)節(jié)腸道節(jié)律運動，還通過激活HPA軸和腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)CRF神經(jīng)元完成應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，來影響腸道運動，使HPA軸促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone,ACTH)水平增加，節(jié)律性減弱，結(jié)腸組織皮質(zhì)醇(cortisol)水平升高[39]。由此可見per2基因與HPA軸的相互作用在腸道功能性疾病的研究有重要意義。

圖6 SCN通過神經(jīng)及體液機制調(diào)節(jié)中樞及臟器活動[34]

5 小結(jié)

應(yīng)激是所有生物對緊張性事件的適應(yīng)性反應(yīng)，對生物的存活具有十分重要的意義。某些刺激能影響生物鐘的輸出和晝夜節(jié)律的表達，這對機體的生理功能和行為都產(chǎn)生影響[40]。杏仁核、海馬等重要的腦內(nèi)核團參與創(chuàng)傷、心理、生理、社會等因素導致的應(yīng)激反應(yīng)的過程。

生物鐘基因在中樞和外周組織均有表達，對全身各系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響。邊緣系統(tǒng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，它對調(diào)節(jié)情緒和應(yīng)激反應(yīng)方面具有重要的作用。PER2蛋白是一個重要的時鐘調(diào)節(jié)器，在維持這些邊緣區(qū)域功能的完整性方面扮演了重要的角色。本文概述了PER2蛋白參與邊緣系統(tǒng)晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)對情緒和內(nèi)臟活動的研究進展，旨在進一步明確晝夜節(jié)律在蛋白水平的表達調(diào)控機制，同時也為應(yīng)激研究和因應(yīng)激產(chǎn)生晝夜節(jié)律紊亂的治療提供研究思路。

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