張 艷 黃可欣 馬洪喜(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，通遼 028007)

珍寶丸又名額爾敦-烏日勒是一種蒙藥制劑，他 的主要成分是29味天然藥材:珍珠、牛黃、犀角、梔子、肉桂、決明子、苘麻子、麝香、檀香、沉香、廣木香、紅花、丁香、川楝子、白苣勝、黑苣勝、蓽撥、螃蟹、甘草、紫檀、白云香、地錦草、海金沙、肉豆蔻、天竺黃、草果、豆蔻、土木香和柯子配合組成［1］。近年來學(xué)者們對(duì)額爾敦-烏日勒進(jìn)行了初步的藥理學(xué)研究［2］，認(rèn)為該藥具有擴(kuò)張毛細(xì)血管、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集和抗血栓，以及保護(hù)神經(jīng)損傷等作用。缺氧性腦病其發(fā)病機(jī)制涉及興奮毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡等多個(gè)方面［3］，因此本實(shí)驗(yàn)通過建立缺氧性腦損傷動(dòng)物模型，旨在從細(xì)胞凋亡方面探索缺氧性腦損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 新生7 d Wistar乳鼠200只，體重(11.3±1.5)g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK2007-吉大-0003)。珍寶丸由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供:哲衛(wèi)準(zhǔn)字(9804-15)號(hào)，珍寶丸配制的濃度0.03 g/kg。兔抗鼠Fas和Fas L一抗購(gòu)于北京博奧森生物有限公司;SP和DAB試劑盒購(gòu)于福州邁新生物有限公司;Fas和Fas L ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、模型建立及給藥方法 新生7 d Wistar大鼠200只，雌雄不限，隨機(jī)分成5組(n=40):正常對(duì)照組、模型缺氧 1 h 組(Ⅰm－12h、Ⅰm－24h、Ⅰm－48h、Ⅰm－72h)、模型缺氧4 h 組(Ⅳm－12h、Ⅳm－24h、Ⅳm－48h、Ⅳm－72h)、珍寶丸缺氧1 h 治療組(ⅠT－14h、ⅠT－24h、ⅠT－48h、ⅠT－72h)、珍寶丸缺氧 4 h 治療組(ⅣT－14h、ⅣT－24h、ⅣT－48h、ⅣT－72h)。將新生Wistar大鼠置于8%O2+92%N2(V/V)的缺氧箱內(nèi)建立新生鼠缺氧模型。在造模前每日一次連續(xù)7 d灌胃給予生理鹽水和珍寶丸，缺氧期間也同樣劑量給藥，分別于缺氧后12、24、48、72 h處死動(dòng)物取血及腦組織待測(cè)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 各組大鼠血清及腦組織懸液中Fas和Fas L蛋白含量的檢測(cè) 摘取眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取上清血清4℃保存待測(cè);取腦組織皮層0.1 g，使用超聲粉碎機(jī)制備0.01%的腦組織懸液，待測(cè);采用ELISA法，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 各組大鼠腦組織中Fas和Fas L蛋白陽性表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，切片4微米厚，60℃烤箱烘片4 h，然后脫蠟至梯度酒精至水洗，抗體稀釋液濃度均為1∶300，其余步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，封片。采用Motic Image Advanced 3.2圖像分析儀，行半定量分析檢測(cè)灰度值，陽性表達(dá)越高灰度值越低，陽性表達(dá)越低灰度值越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)大鼠血清、腦組織Fas和Fas L蛋白含量、蛋白陽性表達(dá)(灰度值)數(shù)據(jù)均以表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清及腦組織懸液中Fas和Fas L蛋白含量的比較 與正常對(duì)照組比較，Ⅰm－12h、Ⅳm－12 h、ⅠT－12 h、ⅣT－12 h 四組 Fas和 Fas L 蛋白含量均在缺氧后12 h時(shí)間點(diǎn)明顯增高，且在Ⅰm－24 h、Ⅳm－24 h、ⅠT－24 h、ⅣT－24 h 即 24 h 時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，模型組在各時(shí)間點(diǎn)上明顯高于治療組;Ⅰm－48 h、Ⅰm－72 h、Ⅳm－48 h、Ⅳm－72 h四組在 48 h、72 h時(shí)間點(diǎn) Fas和Fas L蛋白含量低于12 h時(shí)間點(diǎn)，但仍明顯高于正常對(duì)照組(P ＜0.01);ⅠT－48 h、ⅠT－72 h、ⅣT－48 h、ⅣT－72 h四組在 48、72 h時(shí)間點(diǎn) Fas和 Fas L蛋白含量低于12 h時(shí)間點(diǎn)，但仍高于正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);見表1、2。

2.2 各組大鼠腦組織中Fas和Fas L蛋白陽性表達(dá)的比較 與正常對(duì)照組比較，Ⅰm－12h、Ⅳm－12h、ⅠT－12h、ⅣT－12h四組Fas和Fas L蛋白的陽性表達(dá)均在缺氧后12 h時(shí)間點(diǎn)明顯增高，且在Ⅰm－24h、Ⅳm－24h、ⅠT－24h、ⅣT－24h即24 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，模型組在各時(shí)間點(diǎn)上明顯高于治療組;Ⅰm－48h、Ⅰm－72h、Ⅳm－48h、Ⅳm－72h四組在 48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)Fas和Fas L蛋白的陽性表達(dá)低于12 h時(shí)間點(diǎn)，但仍明顯高于正常對(duì)照組;ⅠT－48h、ⅠT－72h、ⅣT－48h、ⅣT－72h四組在48 h、72 h 時(shí)間點(diǎn) Fas和Fas L蛋白的陽性表達(dá)低于12 h時(shí)間點(diǎn)，但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05);見表3和圖1、2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清中Fas和Fas L蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of protein content of Fas and Fas L in serum of each group at different times points(n=10，)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清中Fas和Fas L蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of protein content of Fas and Fas L in serum of each group at different times points(n=10，)

Note:1)P＜0.01，compared with 24h time points;2)P＜0.01，compared withⅠm group;3)P＜0.05，compared withⅠT group.

12 h 24 h 48 h 72 h Control group 1.45±0.32 1.39±0.27 1.48±0.34 1.46±0.41 1.62±0.35 1.57±0.46 1.65±0.29 1.6 Groups Fas(pg/ml)Fas L(pg/ml)12 h 24 h 48 h 72 h 4±0.33Ⅰm 4.28±0.911) 6.07±1.02 3.29±0.951) 2.74±0.671) 4.66±0.861) 6.45±1.14 3.82±0.831) 3.01±0.711)Ⅳm 4.89±0.951)2) 6.84±0.792) 3.96±0.881)2) 3.17±0.581)2) 5.16±0.941)2) 7.01±1.222) 4.27±0.741)2) 3.51±0.671)2)ⅠT 1.82±0.611) 2.25±0.72 1.66±0.441) 1.63±0.431) 1.97±0.821) 2.43±0.67 1.83±0.561) 1.79±0.721)ⅣT 1.93±0.541)3) 2.69±0.613) 1.71±0.371) 1.69±0.451) 2.11±0.481)3) 2.79±0.573) 1.86±0.521) 1.81±0.461)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織懸液中Fas和Fas L蛋白含量的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of protein content of Fas and Fas L in brain tissue'suspension of each group at different times points(n=10，)

Note:1)P＜0.01，compared with 24 h time points;2)P＜0.01，compared withⅠm group;3)P＜0.05，compared withⅠT group.

12 h 24 h 48 h 72 h Control group 2.01±0.43 2.08±0.51 2.11±0.57 2.02±0.64 2.35±0.49 2.39±0.62 2.32±0.68 2.3 Groups Fas(pg/ml)Fas L(pg/ml)12 h 24 h 48 h 72 h 7±0.55Ⅰm 4.83±0.821) 6.57±0.96 3.88±0.751) 3.31±0.721) 5.34±0.761) 7.01±1.03 4.42±0.911) 3.68±0.841)Ⅳm 5.73±0.891)2) 7.41±1.082) 4.52±0.931)2) 3.92±0.661)2) 6.12±0.971)2) 7.95±1.142) 5.16±0.821)2) 4.33±0.861)2)ⅠT 2.43±0.431) 2.81±0.69 2.26±0.621) 2.31±0.741) 2.71±0.791) 3.03±0.87 2.56±0.651) 2.53±0.611)ⅣT 2.66±0.541)3) 3.09±0.873) 2.29±0.371) 2.24±0.351) 2.98±0.731)3) 3.38±0.713) 2.61±0.581) 2.57±0.631)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織中Fas和Fas L蛋白陽性表達(dá)水平(灰度值)的比較(n=10，)Tab.3 Comparision of protein expression levels of Fas and Fas L in brain tissue of each group at different times points(n=10，)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織中Fas和Fas L蛋白陽性表達(dá)水平(灰度值)的比較(n=10，)Tab.3 Comparision of protein expression levels of Fas and Fas L in brain tissue of each group at different times points(n=10，)

Note:1)P＜0.01，compared with 24 h time points;2)P＜0.01，compared withⅠm group;3)P＜0.05，compared withⅠT group.

12 h 24 h 48 h 72 h Control group 162.45±5.81 159.14±6.07 163.25±4.61 160.83±6.49 165.72±7.16 170.22±5.87 Groups Fas(grey value)Fas L(grey value)12 h 24 h 48 h 72 h 169.46±6.92 171.21±8.23Ⅰm 74.46±5.241) 61.88±3.06 88.28±5.321) 98.71±5.471) 89.27±6.411) 76.87±5.38 102.46±7.531) 121.39±7.521)Ⅳm 63.15±2.751)2) 51.62±2.842) 74.28±3.011)2) 85.72±4.131)2) 75.24±5.311)2) 60.11±3.132) 87.28±6.151)2)100.82±5.351)2)ⅠT 120.06±6.51)2) 103.31±5.592) 139.35±6.191)2)145.21±7.861)2)138.23±8.121)2) 116.42±6.742) 149.82±8.551)2)153.37±6.781)2)ⅣT 117.34±6.461)3) 94.62±7.413) 133.19±4.971) 138.52±6.321) 126.03±5.431)3) 102.19±7.042) 143.58±6.251) 150.35±5.811)

圖1 模型組和珍寶丸治療組Fas蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.1 Expression of Fas protein in model group and treasure pill treatment group(Immunohistochemistry，×200)

圖2 模型組和珍寶丸治療組Fas L蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.2 Expression of Fas L protein in model group and treasure pill treatment group(Immunohistochemistry，×200)

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種基因調(diào)節(jié)的主動(dòng)過程，凋亡是受基因編碼控制的，這些基因的激活及作用依靠細(xì)胞內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，這一過程有許多基因參與如Fas和Fas L等［4］。有研究表明缺氧性腦損傷導(dǎo)致的繼發(fā)性神經(jīng)元死亡、丟失與細(xì)胞凋亡有關(guān)［5］。Fas與Fas L分別屬于腫瘤壞死因子及腫瘤壞死因子受體家族，屬于Fas系統(tǒng)，共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程，主要分布在大腦皮質(zhì)或海馬，主要表達(dá)于胞漿和胞膜，F(xiàn)as抗原包含325個(gè)氨基酸，可以傳導(dǎo)來源于抗Fas抗體和Fas L的死亡信號(hào)［6］。人體的B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞都有Fas的表達(dá)，特別是活化的 T淋巴細(xì)胞，其 Fas的表達(dá)水平更高［7，8］。Fas L 包含 281 個(gè)氨基酸，它可以通過 Fas介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as及其配體Fas L其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞途徑可能為:FasL和Fas的結(jié)合導(dǎo)致Fas死亡區(qū)結(jié)合蛋白(FADD)構(gòu)象發(fā)生改變，隨之FADD與caspases家族的蛋白酶前體結(jié)合后導(dǎo)致后者活化裂解，其裂解產(chǎn)物P10和P20亞基形成異聚體后即成為有活性的半胱氨酸蛋白酶，啟動(dòng)caspases相關(guān)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9，10］。

本研究從生物化學(xué)和免疫組織化學(xué)方面，探討新生大鼠在缺氧后血清及腦組織Fas與Fas L蛋白的變化及其與腦損傷的關(guān)系，正常情況下血清和腦組織Fas與Fas L表達(dá)較少。本研究結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，Ⅰm－12h、Ⅳm－12h、ⅠT－12h、ⅣT－12h四組Fas和Fas L蛋白含量及蛋白的陽性表達(dá)均在缺氧后 12h時(shí)間點(diǎn)明顯增高，且在Ⅰm－24h、Ⅳm－24h、ⅠT－24h、ⅣT－24h即 24 h 時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，模型組在各時(shí)間點(diǎn)上明顯高于治療組;Ⅰm－48h、Ⅰm－72h、Ⅳm－48h、Ⅳm－72h四組在48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)Fas和Fas L蛋白含量及蛋白的陽性表達(dá)低于12 h時(shí)間點(diǎn)但仍明顯高于正常對(duì)照組;ⅠT－48h、ⅠT－72h、ⅣT－48h、ⅣT－72h四組在 48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)Fas和Fas L蛋白含量及蛋白的陽性表達(dá)略低于12 h時(shí)間點(diǎn)，但與正常對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧時(shí)Fas與Fas L均表達(dá)增強(qiáng)，二者顯著正相關(guān)，F(xiàn)as L蛋白和Fas蛋白參與缺氧條件下的凋亡過程，并且Fas蛋白和Fas L均可能促進(jìn)凋亡的進(jìn)程，提示珍寶丸可通過降低缺氧性腦損傷大鼠Fas與Fas L的表達(dá)從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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