黃啟彬 劉明月 符少月 邢 巧 劉瀟淇 王盛典 易發(fā)平

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016)

細(xì)胞因子白細(xì)胞介素21(Interleukins 21，IL-21)主要由CD4+T細(xì)胞中的Th17和NKT細(xì)胞分泌［1］。小鼠IL-21基因位于3號(hào)染色體，緊鄰IL-2基因。成熟的小鼠 IL-21帶有122個(gè)氨基酸殘基［2］。IL-21可促進(jìn)抗CD3抗體活化的胸腺細(xì)胞、成熟外周血T細(xì)胞的增殖，或者在無(wú)抗CD3抗體的刺激下，與IL-2、IL-15、IL-7協(xié)同作用促進(jìn)外周血T細(xì)胞增加［3］。在缺乏抗CD3或其他共刺激因子情況下，IL-21對(duì)T細(xì)胞的增殖則沒有顯著的作用。原始CD8+T細(xì)胞低表達(dá)IL-21R，IL-21并不能單獨(dú)誘導(dǎo)其增殖，而與IL-15或IL-7協(xié)同后就能誘導(dǎo)原始CD8+T細(xì)胞和記憶CD8+T細(xì)胞增殖［4］。然而，IL-21是否能夠影響 T細(xì)胞的其他功能，尤其是對(duì)CD8+T細(xì)胞的直接作用尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)通過重組表達(dá)小鼠白細(xì)胞介素21(mIL-21)和人hIgGFc片段，刺激P1A小鼠CD8+T細(xì)胞，探討其對(duì)CD8+T細(xì)胞的作用，為后續(xù)研究IL-21的作用機(jī)制及其在腫瘤免疫方面的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒 人胚腎細(xì)胞株293E細(xì)胞、大腸埃希菌DH5α、質(zhì)粒PTT3-hIgGFc都由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所提供。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，高保真TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶PmeⅠ和XbaⅠ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自NEB公司，2×PCR mixture購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，Trizol試劑購(gòu)自 Invitrogen公司，IL-2、IL-21 ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司，SDS-PAGE相關(guān)試劑購(gòu)自Biorad公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。BALB/c小鼠，6～8周、體重18～20 g以及P1A小鼠由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 293E細(xì)胞用10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 脾臟淋巴細(xì)胞的分離 取BALB/c小鼠脾臟于RPMI1640完全培養(yǎng)基中。玻片磨砂端輕輕研磨，使細(xì)胞分散。收集細(xì)胞，100 μm篩網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，2 min后加入培養(yǎng)基終止裂解反應(yīng)。1 500 r/min離心5 min，收集脾臟淋巴細(xì)胞。

1.5 小鼠IL-21基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的小鼠IL-21基因序列(NC_000962.2)設(shè)計(jì)引物，上游引物:5'-ATCGGTTTAAACGGAGACTCAGTTCTG-3'(下劃線為PmeⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物:5'-R:AGCTTCTAGAGGAGAAGTGCTGATGAATC-3'(下劃線為XbaⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小為480 bp。用Trizol試劑從小鼠脾臟淋巴細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，擴(kuò)增出IL-21全長(zhǎng)序列。反應(yīng)體系為50 μl:10 ×PCR Buffer(含 Mg2+)5.0 μl，dNTP Mixture(2.5 mol/L)4 μl，cDNA 1.0 μl，上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μl，高保真 Taq DNA 聚合酶 0.5 μl，ddH2O 38.5 μl。反應(yīng)條件為:94℃ 3 min;94 ℃30 s，55 ℃40 s，72℃ 1 min，30次循環(huán)后72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 目的基因克隆及重組質(zhì)粒表達(dá)的大量擴(kuò)增用膠回收試劑盒回收目的片段，限制性內(nèi)切酶PmeⅠ和XbaⅠ定向克隆到PTT3-hIgGFc載體，T4連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂LB平板14 h后，挑取單克隆。提取質(zhì)粒，雙酶切PmeⅠ和XbaⅠ鑒定，并送上海生工進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體 PTT3-mIL-21-hFc轉(zhuǎn)化DH5α菌株，挑取單菌落，接種于5 ml LB培養(yǎng)基(含30 μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)物，按1∶100比例接種于500 ml LB培養(yǎng)基(含 30 μg/ml氨芐青霉素)中，培養(yǎng)至菌液A600=0.6～1.0后，按照天根質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.7 融合蛋白mIL-21-hIgGFc的表達(dá)和純化 當(dāng)293E細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿的密度達(dá)到80%后，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染PTT3-mIL-21-hIgGFc質(zhì)粒。12 h后，加入15 ml(37℃預(yù)熱)DMEM培養(yǎng)基(含0.5%FBS)，48 h后收上清。重新加入10 ml DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收上清。將收集的500 ml上清，4 000 r/min，4℃離心5 min除去死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，再用0.22 μm濾膜過濾除去更小一些的顆粒物，得到培養(yǎng)上清，經(jīng)MOLLIPORE LabscaleTMTFF system(5 kD濾膜)濃縮至20 ml，加到預(yù)處理的Protein G瓊脂糖柱，流速1 ml/min，重復(fù)上樣兩遍。10倍柱體積binding buffer洗柱，除去雜蛋白;10倍柱體積elution buffer洗脫，收集洗脫液。截留分子量10 000的MILLIPORE超濾管濃縮至1 ml。0.22 μm濾膜過濾、分裝凍存于－80℃，備用。

1.8 融合蛋白mIL-21-hIgGFc檢測(cè) eBioscience公司ELISA試劑盒檢測(cè)融合蛋白mIL-21-hIgGFc濃度，具體步驟參照說(shuō)明書。酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算融合蛋白mIL21-hIgGFc濃度。同時(shí)10%SDS-PAGE凝膠電泳分析監(jiān)測(cè)整個(gè)生產(chǎn)純化融合蛋白的過程，以確定得到的融合蛋白的純度和質(zhì)量。

1.9 融合蛋白mIL-21-hIgGFc對(duì)CD8+T細(xì)胞表型的影響 處死P1A小鼠，取出脾臟、雙側(cè)腋下和腹股溝4個(gè)淋巴結(jié)，玻片研磨成勻漿，100 μm篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸液。紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，1 500 r/min，離心10 min，收集淋巴細(xì)胞。1 ml MACS buffer重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。加入抗體CD8-FITC，4℃孵育20 min。20 ml MACS buffer 4℃終止抗體孵育，1 500 r/min，離心10 min。棄上清，900 μl MACS buffer重懸細(xì)胞，加入100 μl Anti-FITC 微珠，4～8℃孵育20 min，離心收集細(xì)胞。1 ml MACS buffer重懸，分離柱過濾，收集CD8+T細(xì)胞。同時(shí)用免疫磁珠陽(yáng)選淋巴細(xì)胞中的CD11C+細(xì)胞，加入1 μg/ml P1A抗原肽，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)后，離心收集CD11C+細(xì)胞。將CD8+T細(xì)胞和CD11C+細(xì)胞按1∶10混合后，以5×105/孔接種于96孔板，分別用100 ng/ml融合蛋白mIL-21-hIgGFc和小鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)刺激72 h后，檢測(cè)CD44、CD62L表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 mIL-21基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 mIL-21基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約400～500 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期一致，如圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 PmeⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，理論上酶切產(chǎn)物小片段大小為463 bp。電泳結(jié)果與預(yù)期相符，如圖2。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示目的基因與IL-21基因序列完全一致。這些結(jié)果表明，構(gòu)建的質(zhì)粒PTT3-IL21-hIgGFc完全正確。

圖1 mIL-21基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of mIL-21 gene

2.3 融合蛋白mIL21-hIgGFc的表達(dá)量 ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，PTT3-mIL-21-hIgGFc轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞可檢測(cè)mIL21-hIgGFc蛋白的表達(dá)，而在沒有轉(zhuǎn)染的293E上清中不能檢測(cè)到mIL21-hIgGFc。經(jīng)計(jì)算，上清中的融合蛋白濃度為787 ng/ml。純化后一共得到約0.5 mg融合蛋白 mIL21-hIgGFc。SDS-PAGE分析顯示，細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)HiTrapTMProtein G柱純化后，獲得蛋白純度高，雜蛋白較少，如圖3。

2.4 融合蛋白mIL-21-hIgGFc對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響 如圖4所示，融合蛋白mIL-21-hIgGFc可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的CD44lowCD62LhiCD8+T細(xì)胞，而白細(xì)胞介素2(IL-2)和陰性對(duì)照組不具有這樣的功能。CD44lowCD62LhiCD8+T細(xì)胞同其他亞型的CD8+T細(xì)胞，具有更好的記憶功能，在腫瘤的過繼免疫治療中可能會(huì)發(fā)揮重要作用。

圖2 重組質(zhì)粒PTT3-mIL-21-hIgGFc的雙酶切(PmeⅠ和XBalⅠ)鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid PTT3-mIL-21-hIgGFc(PmeⅠ/XBalⅠ)

圖3 純化mIL-21-FCFc蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profiles of purified mIL-21-hIgGFc

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mIL21-hIgGFc對(duì)CD8+T表型的影響Fig.4 Phenotypic effects of mIL21-hIgGFc on CD8+T by flow cytometry

3 討論

在有抗原刺激時(shí)，IL-21R在B細(xì)胞和T細(xì)胞上的表達(dá)均增加。在T細(xì)胞中，TCR誘導(dǎo)的IL-21R表達(dá)增加主要是由于TCR介導(dǎo)的Sp1蛋白增加及其脫磷酸化作用［5］。IL-21 與 IL-2、IL-4、IL-7 和 IL-15一樣，是γ鏈細(xì)胞因子家族的一員，可以通過與其受體IL-21R的結(jié)合作用于多種細(xì)胞。IL-21與其受體結(jié)合后能啟動(dòng)下游信號(hào)，最終活化STAT3、STAT1和STAT5，在免疫細(xì)胞的發(fā)育、增殖、活化和遷移過程中發(fā)揮重要功能［6］。IL-21能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，在炎癥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫中都起著舉足輕重的作用。研究人員在不同模型中證明了IL-21的抗腫瘤作用，其機(jī)制主要在于NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，以及減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量［7-9］。臨床實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)表明，IL-21具有較好的治療腫瘤的效果。

在腫瘤的免疫治療方面，過繼免疫治療越來(lái)越引起人們的重視。過繼細(xì)胞治療(Adoptive cell therapy，ACT)指自體免疫細(xì)胞進(jìn)行體外激活和擴(kuò)增至一定數(shù)量后回輸至腫瘤患者體內(nèi)，在體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用的治療方法［10］。從腫瘤組織中分離出的CD4+、CD8+T細(xì)胞，在體外經(jīng)白介素(Interleukin，IL)的刺激、活化、擴(kuò)增后可應(yīng)用于臨床腫瘤過繼細(xì)胞治療。CD8+記憶T細(xì)胞可能會(huì)取代傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性 T細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)，成為過繼免疫治療(Adoptive immunotherapy)細(xì)胞，它們將會(huì)發(fā)揮持久而強(qiáng)大的治療作用［11］。Hinrichs等［12］發(fā)現(xiàn)，IL-21和IL-2對(duì)CD8+T細(xì)胞有對(duì)立的分化作用，即IL-21抑制了抗原誘導(dǎo)的初始CD8+T細(xì)胞向效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的活化，同時(shí)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)淋巴細(xì)胞歸巢受體，從而在腫瘤的過繼免疫治療中發(fā)揮更好的作用，進(jìn)一步研究表明，記憶性CD8+前體 T細(xì)胞的功能成熟依賴 IL-10-IL-21-STAT3 信號(hào)通路［13］。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒PTT3-mIL-21-hIgGFc，轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，收集培養(yǎng)液上清，濃縮純化獲得mIL-21-hIgGFc融合蛋白。用該蛋白處理陽(yáng)選的P1A小鼠CD8+T細(xì)胞，同時(shí)陽(yáng)選出CD11C+細(xì)胞(預(yù)先給予抗原肽刺激)，共培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mIL-21-hIgGFc融合蛋白可以增加CD8+T細(xì)胞中CD44lowCD62Lhi的比例，而CD44lowCD62LhiCD8+具有免疫記憶和干細(xì)胞的特性，在殺傷癌細(xì)胞方面具有更大的優(yōu)勢(shì)［12，14］。這些結(jié)果為后續(xù)研究IL-21在腫瘤過繼免疫治療方面的作用奠定一些基礎(chǔ)，或許有助于在體外培養(yǎng)出足夠數(shù)量的CD44lowCD62LhiCD8+T細(xì)胞，再回輸患者體內(nèi)，用于腫瘤治療。

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