徐 丹 姜 潮 陳 昱 艾 君 王曉艷 李校堃

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)引起的通過空氣傳播的人獸共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，在2011年，約有870萬(wàn)名新增結(jié)核病例(13%感染了艾滋病病毒)和140萬(wàn)人死于結(jié)核?。?］。結(jié)核病已成為我國(guó)乃至世界危害最嚴(yán)重的疾病之一。1921年，Calmette和Guérin研制出減毒分枝桿菌Bacille Calmette-Guérin(BCG)，BCG是目前應(yīng)用最廣泛的結(jié)核分枝桿菌疫苗，但BCG保護(hù)力不穩(wěn)定為0～80%，BCG不能提供有效的免疫保護(hù)力來(lái)抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染，尤其對(duì)處于潛伏期的結(jié)核病患者不會(huì)產(chǎn)生任何效果［2，3］，所以急需一種有效的疫苗來(lái)控制結(jié)核病的蔓延，目前研究最多的是重組BCG、DNA疫苗和亞單位疫苗。

MPB64蛋白是MTB基因組RD2區(qū)基因編碼的蛋白，分子量約為23 kD，只存在于MTB毒株中，不存在于BCG中［4］。MPB64是MTB培養(yǎng)物濾過蛋白的主要成分之一，占分泌蛋白總量的8%，亦是最早被發(fā)現(xiàn)的MTB復(fù)合群特異性抗原，可誘導(dǎo)肺結(jié)核患者的淋巴細(xì)胞增殖并可產(chǎn)生高水平的IFN-γ，能引起較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫，具有開發(fā)成結(jié)核病亞單位疫苗和檢測(cè)試劑盒的潛力。本研究在桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中表達(dá)MPB64，希望獲得具有免疫原性的重組蛋白，為MPB64的表達(dá)提供新途徑，為結(jié)核病的檢測(cè)和亞單位疫苗的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒細(xì)菌 含有MPB64-His基因序列(昆蟲密碼子優(yōu)化)的pUC57載體、E.coli DH5α菌種均由本實(shí)驗(yàn)室保存;pFastBac載體、E.coli DH10Bac感受態(tài)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 試劑盒 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)試劑盒、Sf 9昆蟲細(xì)胞、Sf-900II無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自 Invitrogen;PCR酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker 10 000、DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司;His標(biāo)簽抗體購(gòu)自abcom公司;BALB/c小鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(18只，雌性，6～8周齡);IFN-γ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海巧伊生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)引物 從pUC57-CFP10-ESAT-6-MPB64-His載體中擴(kuò)增MPB64-His目的基因片段，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的上游引物和下游引物，通過PCR克隆得到N端含有6個(gè)His標(biāo)簽的MPB64基因，上游引物 5'CGGGATCCATGAGGATAA3'，下游引物5'CTGCAGCTAGTGATGGTGATG3'。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系 上下游引物各1 μl，模板質(zhì)粒 1 μl，ExTaq 酶 0.25 μl，dNTP 4 μl，10 × buffer 5 μl，超純水 37.75 μl，50 μl反應(yīng)體系。94℃ 預(yù)變性 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)后72℃延伸8 min。

1.2.3 重組pFastBac-MPB64-His載體的構(gòu)建PCR獲得的MPB64-His片段和pFastBac質(zhì)粒分別用BamHⅠ和PstⅠ酶雙酶切并回收需要的片段，目的片段與空載體pFastBac連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑選單菌落進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證并由華大基因測(cè)序，測(cè)序正確的單克隆提質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 重組Bacmid-MPB64-His載體的構(gòu)建pFastBac-MPB64-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有Bacmid載體的DH10Bac感受態(tài)(方法根據(jù)說(shuō)明書)，轉(zhuǎn)化后的DH10Bac 菌涂布在五抗(K 50 μg/ml，T 10 μg/ml，G 7 μg/ml，IPTG 40 μg/ml，X-gal 100 μg/ml)固體培養(yǎng)基的平皿上，37℃倒置培養(yǎng)48 h，藍(lán)白斑鑒定陽(yáng)性菌落，挑取單菌落在五抗平皿中劃線培養(yǎng)，至整個(gè)平皿中只有白色菌落，挑取單菌落利用Bacmid中的M13片段和目的基因片段兩端引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 重組桿狀病毒的制備 取兩份100 μl的SF-900Ⅱ培養(yǎng)基，一份加入 8 μl重組 Bacmid-MPB64-His質(zhì)粒，另一份加入6 μl Cellfectin Reagen試劑，將兩份溶液混合均勻并室溫孵育45 min，6孔板加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf 9細(xì)胞，每孔1.0×106個(gè)，27℃靜止培養(yǎng)1 h，輕輕移去培養(yǎng)基，加入上述混合物，27℃靜止培養(yǎng)4 h，移去上述混合溶液，加入2 ml培養(yǎng)基，濕盒中27℃培養(yǎng)72 h后可以看到細(xì)胞發(fā)生病變，當(dāng)發(fā)生病變的細(xì)胞大于50%時(shí)，收細(xì)胞和培養(yǎng)基，800 r/min離心5 min，取上清即是P1代病毒，P1代病毒加入2%胎牛血清4℃避光儲(chǔ)存。P1代病毒連續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞3次獲得P4代病毒。

1.2.6 測(cè)定P4代病毒滴度 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入6孔板，每孔2 ml 5×105個(gè)/ml，貼壁培養(yǎng)過夜，P4代病毒用培養(yǎng)基稀釋成103～108，移去上清液，每孔加病毒稀釋液1 ml，27℃培養(yǎng)1 h后，移去病毒液，將提前在40℃保溫的4%低熔點(diǎn)瓊脂和1.3×的培養(yǎng)基按1∶3比例混合，并迅速加入6孔板，自然凝固后置于27℃濕盒中靜止培養(yǎng)10～15 d，至每孔中的蝕菌斑數(shù)連續(xù)2 d不變，選擇蝕斑數(shù)在3～20個(gè)的孔，病毒滴度的計(jì)算公式:滴度(pfu/ml)=每孔蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/1 ml。

1.2.7 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化 用P4代病毒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞密度2×106個(gè)/ml，27℃搖床100 r/min 培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣(24、48、60、72、84、96、108、120 h)，并取同樣細(xì)胞設(shè)不同感染復(fù)數(shù)(2，3，4，5，6)組，96 h后取樣，SDS-PAGE電泳后，取膠300 mA轉(zhuǎn)膜75 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，2.5%脫脂奶粉2 000倍稀釋anti-his單克隆抗體，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，3 000倍稀釋二抗，室溫孵育1 h，TBST稀釋3次，曝光。

1.2.8 蛋白純化 A液為20 mmol/L PB，pH8.0;B液為20 mmol/L PB+500 mmol/L NaCl，pH8.0;C 液為20 mmol/L PB+400 mmol/L咪唑，pH8.0。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)pH至8.0上Q柱100%A液平衡，16%B液沖洗雜蛋白，30%B液洗脫目的蛋白，100%B液再生Q柱。Q柱收集液上Ni柱，A液平衡，7.5%C液沖洗雜蛋白，50%C液洗脫目的蛋白，100%C液再生Ni柱。純化后蛋白超濾離心除鹽，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，利用灰度分析測(cè)定純度，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2.9 免疫小鼠 BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組，每組6只?？瞻讓?duì)照組腹腔注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注射卡介苗BCG，實(shí)驗(yàn)組采用腹腔注射MPB64蛋白免疫BALB/c小鼠3次，每只每次0.05 mg(生理鹽水組0.2 ml/只)，每次間隔2周，每次免疫后第3天斷尾取血，血清儲(chǔ)存在－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10 血清中抗體滴度的檢測(cè) BCG和純化的蛋白MPB64分別在碳酸鹽包被緩沖液中稀釋到1.0 μg/ml，100 μl/孔包被酶標(biāo)板 4℃過夜，PBST 洗3次，分別加入PBS稀釋的血清100 μl/孔，20倍稀釋起始，依次倍比稀釋12個(gè)濃度梯度，空白孔用PBS代替，37℃孵育2 h，PBST 洗3次，每孔100 μl加5 000倍稀釋的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗3次，加底物顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.2.11 脾臟細(xì)胞分泌IFN-γ的檢測(cè) BALB/c小鼠免疫后第9周處死，無(wú)菌條件下分離脾臟細(xì)胞，每孔40萬(wàn)個(gè)細(xì)胞鋪96孔板。每孔加入10 μg培養(yǎng)基稀釋的MPB64蛋白，空白對(duì)照加入等量培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h后取上清，ELISA方法檢測(cè)血清中IFN-γ濃度，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書。

1.2.12 重組蛋白MPB64對(duì)脾臟細(xì)胞的增殖活性

BALB/c小鼠免疫后第9周處死，無(wú)菌條件下分離脾臟細(xì)胞，每孔40萬(wàn)個(gè)細(xì)胞鋪96孔板。稀釋成不同濃度的重組蛋白給藥，最高濃度100 μg/孔，連續(xù)2倍稀釋10個(gè)梯度。以 PBS作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)72 h后每孔加25 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心的除去上清，每孔加120 μl DMSO，震蕩10 min至結(jié)晶溶解。在630 nm和570 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算重組蛋白對(duì)脾臟細(xì)胞的增殖活性。

2 結(jié)果

2.1 Bacmid-MPB64-His表達(dá)載體構(gòu)建示意圖 桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid-MPB64-His的構(gòu)建，如圖1所示?？寺〉腗PB64-His基因插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac的BamHⅠ和 PstⅠ酶切位點(diǎn)之間。重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-MPB64-His轉(zhuǎn)染DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，并在幫助質(zhì)粒的作用下與DH10Bac中的表達(dá)載體Bacmid在mini-Tn7位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)座，獲得重組MPB64-His質(zhì)粒。

2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 MPB64-His基因包括MPB64的687 bp和其后的His標(biāo)簽以及加兩端的酶切位點(diǎn)共744 bp，結(jié)果與預(yù)期一致，如圖2所示。

2.3 重組pFastBac-MPB64-His質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證提取pFastBac-MPB64-His質(zhì)粒，用 BamHⅠ和 PstⅠ雙酶切，酶切大小片段與預(yù)期結(jié)果一致，如圖3所示。

2.4 重組Bacmid-MPB64-His載體的PCR驗(yàn)證提取Bacmid-MPB64-His質(zhì)粒，以MPB64-His的上游引物和M13的下游引物做PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果與預(yù)期值1 223 bp一致，如圖4所示。

圖1 桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant baculovirus expression vector

圖2 PCR擴(kuò)增MPB64-His基因Fig.2 PCR product of MPB64-His gene

2.5 昆蟲細(xì)胞感染病毒后的形態(tài)學(xué)鑒定 重組Bacmid-MPB64-His載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞感染病毒72 h后，在顯微鏡下觀察形態(tài)變化，細(xì)胞停止生長(zhǎng)分裂，細(xì)胞內(nèi)有粒狀物出現(xiàn)，細(xì)胞表面出芽，出泡，部分細(xì)胞裂解，如圖5所示。

圖3 pFastBac-MPB64-His雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pFastBac-MPB64-His

圖4 PCR鑒定重組桿狀病毒DNAFig.4 Identification of recombinant baculovirus DNA by PCR

2.6 蛋白的表達(dá) P3代病毒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲細(xì)胞，72 h后收集上清經(jīng)15%SDS-PAGE電泳顯示在23 kD有蛋白表達(dá)，如圖6所示。P4代病毒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲細(xì)胞，收集上清做Western blot鑒定，證明細(xì)胞感染病毒48 h后有蛋白表達(dá)，96 h時(shí)蛋白表達(dá)量最高，感染復(fù)數(shù)(MOI)為4時(shí)蛋白收獲最高，如圖7所示。

2.7 蛋白的純化 收集上清上樣于Q柱，洗脫樣品在SDS-PAGE電泳顯示目的條帶在含0.15 mol/L NaCl的PB緩沖液中洗脫，洗脫樣品上樣于Ni親和層析柱，用含咪唑的PB緩沖液洗脫，樣品經(jīng)12%SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白在含0.2 mol/L咪唑的PB緩沖液中洗脫?；叶确治鰷y(cè)定蛋白純度為91%。洗脫樣品除鹽后測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上清中蛋白收量為35 mg/L，如圖8所示。

2.8 血清中抗體效價(jià)測(cè)定 MPB64免疫組血清中抗體效價(jià)的測(cè)定在20～5 120倍間呈S形曲線，最佳稀釋倍數(shù)為2 000倍。MPB64免疫組明顯高于BCG對(duì)照組，結(jié)果如圖9所示。

圖5 正常及感染后的Sf 9細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Normal Sf 9 and Sf 9 cells infected after 72 h

圖6 病毒感染細(xì)胞后的蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expression after virus infected cells

圖7 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間和感染復(fù)數(shù)表達(dá)蛋白表達(dá)情況Fig.7 Detection of expression of recombinant MPB64-His protein in different infection time and various MOI infection by Western blot

圖8 MPB64蛋白純化結(jié)果Fig.8 Purification of MPB64

圖9 血清抗體的滴度Fig.9 Serum antibody titer

2.9 脾臟細(xì)胞分泌IFN-γ的檢測(cè) 免疫后的第9周，取小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板，加入10μg蛋白MPB64刺激，72 h后培養(yǎng)基中IFN-γ的含量為35.75 pg/ml，明顯高于空白對(duì)照組的1.28 pg/ml，如圖10所示。

圖10 培養(yǎng)基上清中IFN-γ的含量Fig.10 Supernatant levels of IFN-γ

圖11 MPB64促脾臟細(xì)胞增殖研究Fig.11 MPB64 promoted splenic lymphocytes cells proliferation

2.10 重組蛋白對(duì)脾臟細(xì)胞的增殖活性驗(yàn)證 酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光值，數(shù)據(jù)如圖11所示，由數(shù)據(jù)顯示重組蛋白對(duì)免疫過的小鼠脾臟細(xì)胞有明顯的促增殖作用，在蛋白濃度0.2～100 μg/ml之間呈劑量依賴性。

3 討論

自1990年以來(lái)，TB已經(jīng)受到世界各國(guó)的重視，每年新增病例以及死亡人數(shù)持續(xù)減少，但由于耐藥TB的出現(xiàn)以及結(jié)核病例感染艾滋病毒，使得TB控制的進(jìn)展極為緩慢。我國(guó)在全球22個(gè)TB重災(zāi)區(qū)中僅次于印度排名第二［5，6］。TB的治療費(fèi)用高，且因耐藥甚至耐多藥株的出現(xiàn)使TB的多種藥物作用降低，尤其是耐多藥TB的治療副作用較大，治療周期延長(zhǎng)。

BCG仍是目前預(yù)防TB唯一可用的疫苗。BCG的制備和傳代過程中丟失了部分與保護(hù)力相關(guān)的基因。接種BCG可顯著降低兒童TB的發(fā)病率和死亡率，但對(duì)成人的免疫效果極不穩(wěn)定，保護(hù)力為0～80%，而且BCG仍存在一定毒力，最近研究顯示BCG與臨床致病結(jié)核分枝桿菌有很大不同，BCG對(duì)流行的臨床菌株北京株缺乏有效作用［7］。

亞單位疫苗與BCG相比，具有組分明確、生產(chǎn)周期短、價(jià)格低廉、無(wú)毒安全等優(yōu)點(diǎn)，已受到國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的青睞，目前已知的保護(hù)性抗原有MTB早期分泌蛋白ESAT6、CFP10、MPB64和Ag85B復(fù)合物等［8］。

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)是1983年由Smith等［9］建立，具有蛋白表達(dá)水平高、周期短、對(duì)目的蛋白有翻譯后修飾作用等優(yōu)點(diǎn)［10，11］。它幾乎可以表達(dá)任何生物(從細(xì)菌到人體組織)的基因產(chǎn)物和進(jìn)行任何細(xì)胞定位(細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外周質(zhì))，已廣泛用于生物制藥、基因工程及疫苗的研究及生產(chǎn)，其中在該系統(tǒng)中生產(chǎn)的流感疫苗和豬瘟亞單位疫苗具有良好的效果［12，13］。

本實(shí)驗(yàn)在桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)成功地表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌蛋白MPB64并進(jìn)行純化，又進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白MPB64的免疫原性，證明重組蛋白可以刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生抗體，提高BALB/c小鼠血清中IFN-γ的含量。IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷能力，抑制MTB生長(zhǎng)，最終產(chǎn)生抗TB的保護(hù)效應(yīng)。

目前，我國(guó)結(jié)核感染皮試診斷及流行病學(xué)調(diào)查主要采用PPD(結(jié)核桿菌精致純蛋白衍生物)皮試。但PPD中存在致病性分枝桿菌、環(huán)境中的分枝桿菌及BCG所共有的抗原，因而不能區(qū)分BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結(jié)核桿菌感染，特異性和敏感性均不理想。因MPB64只存在于致病性結(jié)核分枝桿菌，不存在于作為疫苗的BCG中，純化后的重組蛋白除可作為疫苗外，可用于制備檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)接種人群的抗體表達(dá)量。對(duì)比PPD檢測(cè)可以區(qū)別BCG免疫和MTB感染。本課題組在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，將繼續(xù)對(duì)MPB64免疫原性進(jìn)一步檢測(cè)，并對(duì)重組蛋白MPB64進(jìn)行保護(hù)力的探究和嘗試，利用重組蛋白MPB64對(duì)TB檢測(cè)進(jìn)行開發(fā)。

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