王曉天+劉曉梅+尤紅娟+李小翠+秦蘇萍+湯仁仙+宋遠見

[摘要] 目的 探討JNK磷酸化Bad在大鼠缺血性神經(jīng)元凋亡中的作用。 方法 20只大鼠均分為4組：假手術(shù)組、缺血復灌組、溶劑對照組和SP600125組。制作大鼠全腦缺血模型，應用免疫沉淀和免疫印跡法檢測大鼠腦缺血復灌1 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bad與14-3-3及Bad與Bcl-Xl的結(jié)合、Bad絲氨酸128位磷酸化[p-Bad（S128）]水平、Caspase-3蛋白表達情況。 結(jié)果 與缺血復灌組相比，SP600125組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bad與14-3-3的結(jié)合明顯增高，Bad與Bcl-Xl的結(jié)合、p-Bad（S128）、Caspase-3表達顯著減少（均P<0.05）。 結(jié)論 JNK介導的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。

[關(guān)鍵詞] Bad；JNK絲裂原活化蛋白激酶類；凋亡；腦缺血

[中圖分類號] R743.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）31-0001-03

Effects of Bad phosphorylation induced by JNK on cerebral ischemic neuronal apoptosis

WANG Xiaotian LIU Xiaomei YOU Hongjuan LI Xiaocui QIN Suping TANG Renxian SONG Yuanjian

Department of Pathogenic Biology and Immunology， Xuzhou Medical College， Xuzhou 221002， China

[Abstract] Objective Investigate the effects of Bad phosphorylation induced by JNK on cerebral ischemic neuronal apoptosis in rats. Methods Twenty rats were divided into 4 groups averagely： sham operation group， ischemia-reperfusion group， solvent control group and SP600125 group. Making rat model of cerebral ischemia， the binding of Bad and 14-3-3，the binding of Bad and Bcl-Xl， Bad phosphorylation at serine 128（p-Bad（S128）） and Caspase-3 protein expression in hippocampal CA1 region were detected by immunoprecipitation（IP） and immunoblotting（IB） 1d after ischemia-reperfusion. Results Compared with the ischemia-reperfusion group， the binding of Bad and 14-3-3 was increased， the binding of Bad and Bcl-Xl， p-Bad（S128） and Caspase-3 protein expression in hippocampal CA1 region were decreased in SP600125 group （All P<0.05）. Conclusion Bad phosphorylation at serine 128 induced by JNK playe important effects on cerebral ischemic neuronal apoptosis in rats.

[Key words] Bad； JNK mitogen-activated protein kinases； Apoptosis； Cerebral ischemia

Bcl-2 antagonist of cell death（Bad）是Bcl-2家族促凋亡蛋白之一，在缺血性腦中風引起的神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮了重要作用。Bad絲氨酸136位被Akt磷酸化后即可與14-3-3蛋白結(jié)合，形成一個非活化的復合體，阻止Bad介導的凋亡[1，2]；相反，在凋亡刺激下，Bad去磷酸化與14-3-3分離，轉(zhuǎn)位到線粒體外膜與Bcl-Xl形成異二聚體，中和后者的抗凋亡作用[3]。最近有人報道，c-Jun氨基末端激酶（JNK）可使Bad絲氨酸128位磷酸化，誘導細胞凋亡[4]。為此，本實驗利用大鼠全腦缺血模型，通過注射JNK抑制劑SP600125，觀察其對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bad（S128）磷酸化水平、Bad線粒體轉(zhuǎn)位及Caspase-3蛋白表達的影響，探討JNK介導的Bad磷酸化在大鼠腦缺血性神經(jīng)元凋亡中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 正常健康雄性SD大鼠20只，體重250～300g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Bad、14-3-3抗體（Santa Cruz Biotechnology公司），Bcl-Xl抗體（Cell Signaling Biotechnology公司），p-Bad（S128）抗體（Biosource公司），active-Caspase-3抗體（Sigma公司），SP600125（Biomol公司）。

1.2 方法

1.2.1模型制備及分組 20只大鼠均分為4組：假手術(shù)組、缺血復灌組、溶劑對照組和SP600125組。采用四動脈結(jié)扎法制作全腦缺血模型[5]，將大鼠麻醉后，分離其雙側(cè)頸總動脈并電凝椎動脈，次日于清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，全腦缺血15 min，再灌注1 d處死，為缺血復灌組。假手術(shù)組的處理同缺血復灌組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。SP600125組將3 g/L的SP600125溶于1%二甲基亞砜（DMSO），于缺血前20 min腦室注射，10 μL/只，10min內(nèi)注射完[6]。溶劑對照組于缺血前20min腦室注射等體積1% DMSO。

1.2.2 樣本制備 大鼠腦缺血15 min再灌注1 d后，斷頭快速取腦，分離雙側(cè)海馬，沿海馬裂將其分為CA1和CA3-DG兩部分，CA1部分置液氮中凍存?zhèn)溆?。以下操作均在冰水浴中進行：從液氮中取出海馬CA1部分加勻漿緩沖液，勻漿，1000×g離心15 min，小心移取上清液，主要為海馬的胞漿部分，BCA法測蛋白濃度后行免疫沉淀及免疫印跡分析。

1.2.3免疫沉淀 取等量胞漿部分蛋白質(zhì)樣品，加入5倍體積IP緩沖液，以25 μL蛋白A/G-瓊脂糖預吸附1 h，10 000×g離心2 min，取上清，加入1～2 μg 抗體，旋轉(zhuǎn)混勻過夜，再加入25 μL蛋白A/G-瓊脂糖，旋轉(zhuǎn)混勻2 h，10 000×g離心2min，沉淀用IP緩沖液洗3遍，蛋白變性處理后，10 000×g離心2 min，吸上清行免疫印跡分析， 以Bad/14-3-3、Bad/Bcl-Xl分別表示胞漿中Bad與14-3-3、Bad與Bcl-Xl蛋白結(jié)合情況。

1.2.4免疫印跡 取等量的變性蛋白質(zhì)樣本（100μg）或IP樣本，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育2 h，顯色。掃描膜上顯色條帶并用ImageJ軟件分析，蛋白表達相對值以各組蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值來表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組p-Bad（S128）蛋白表達水平的比較

與假手術(shù)組相比，缺血復灌組、溶劑對照組和SP600125組p-Bad（S128）水平明顯增高；與缺血復灌組和溶劑對照組相比，SP600125組的p-Bad（S128）水平顯著降低（P均<0.05）。溶劑對照組與缺血復灌組差異無統(tǒng)計學意義，4組Bad蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。詳見圖1、表1。

圖1 4組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-Bad（S128）、Bad蛋白表達

表1 4組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-Bad（S128）蛋白表達水平比較（x±s，n=5）

注：F=103.76，P<0.05；1vs2，q=0.871，P>0.05；1vs3，q=12.226，P<0.05； 1vs4，q=21.435，P<0.05；2vs3，q=11.356，P<0.05；2vs4，q=20.565，P<0.05； 3vs4，q=9.209，P<0.05

2.2 4組Bad與14-3-3及Bad與Bcl-Xl結(jié)合、Caspase-3蛋白表達水平的比較

與假手術(shù)組相比，缺血復灌組、溶劑對照組和SP600125組Bad與14-3-3的結(jié)合減少，Bad與Bcl-Xl結(jié)合、Caspase-3表達水平增多；與缺血復灌組和溶劑對照組相比，SP600125組Bad與14-3-3的結(jié)合明顯增多，Bad與Bcl-Xl的結(jié)合、Caspase-3表達水平顯著降低（P均<0.05）。溶劑對照組與缺血復灌組相比，Bad與14-3-3及Bad與Bcl-Xl結(jié)合、Caspase-3表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。4組14-3-3、Bcl-Xl蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。詳情請參見圖2、表2和表3。

圖2 4組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bad與14-3-3及Bad與Bcl-Xl結(jié)合、14-3-3、Bcl-Xl和Caspase-3蛋白表達

表2 4組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bad與14-3-3結(jié)合情況比較

（x±s，n=5）

注：F=53.508，P<0.05；1vs2，q=8.006，P<0.05；1vs3，q=14.932，P<0.05； 1vs4，q=15.832，P<0.05；2vs3，q=6.926，P<0.05；2vs4，q=7.826，P<0.05； 3vs4，q=0.901，P>0.05

3 討論

哺乳動物中，Bcl-2家族成員多達20余種，他們均分別含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（Bcl-2 homology domain，BH domain）。根據(jù)所含BH結(jié)構(gòu)域及功能的不同，Bcl-2家族蛋白被分為三類：含有BH1-BH4 保守結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制蛋白如Bcl-2，Bcl-Xl，Bcl-w等；含有BH1-BH3結(jié)構(gòu)域的凋亡促進蛋白如Bax，Bak等；只含有BH3結(jié)構(gòu)域的凋亡促進蛋白如Bad，Bim，DP5，Bid等[7]。Bad是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡成員，它的功能主要是由磷酸化狀態(tài)的變化來調(diào)節(jié)的，由此調(diào)控下游蛋白之間的相互作用和亞細胞定位[8]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞存活信號激酶Akt可磷酸化Bad絲氨酸136位，Bad磷酸化后與胞漿蛋白14-3-3結(jié)合，消除Bad的促凋亡功能[9]。而在凋亡刺激下，Bad去磷酸化后與14-3-3分離，并轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，與Bcl-Xl結(jié)合形成異二聚體，抑制后者抗凋亡活性。因此，一直以來，人們認為非磷酸化的Bad是它的活化形式，Bad磷酸化后即失去凋亡活性。但是，最近有人發(fā)現(xiàn)Bad絲氨酸128位被JNK磷酸化后，卻可成為它的活化形式，誘導細胞凋亡[4]。

JNK是絲裂原活化的蛋白激酶家族的成員，可被紫外線照射、炎性因子、生長因子撤除等多種凋亡刺激所激活[10-11]。JNK信號通路在腦缺血再灌注誘導的神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮了重要作用。短暫腦缺血后JNK即被激活[12]，激活的JNK順次磷酸化其核底物如c-Jun和胞漿底物如Bcl-2、14-3-3等，誘導神經(jīng)元凋亡。本實驗為了證明腦缺血中JNK能否磷酸化另一胞漿底物Bad，我們選擇了JNK特異性抑制劑SP600125作為工具藥進行研究，結(jié)果顯示：與缺血復灌組相比，SP600125組的p-Bad（S128）蛋白表達明顯降低，提示在腦缺血復灌過程中JNK可以使Bad（Ser-128）磷酸化。

接著，我們檢測到：與缺血復灌組相比，SP600125組Bad與14-3-3的結(jié)合明顯增高，Bad與Bcl-Xl的結(jié)合、Caspase-3蛋白表達顯著減少。結(jié)果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后干擾了Bad與14-3-3的結(jié)合，Bad隨后與14-3-3分離，轉(zhuǎn)位到線粒體外膜與Bcl-Xl結(jié)合，促進了線粒體內(nèi)凋亡因子的釋放，進而誘導神經(jīng)元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以會誘導Bad線粒體轉(zhuǎn)位，可能是由于Bad絲氨酸128位與絲氨酸136位在空間構(gòu)型上比較接近，絲氨酸128位磷酸化修飾從空間構(gòu)型上干擾了絲氨酸136位與14-3-3的相互作用[4]。然而，絲氨酸128位磷酸化也可能是通過與其他蛋白相互作用，破壞了14-3-3與磷酸化的絲氨酸136位的結(jié)合[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常細胞內(nèi)，Bcl-xL與Bax結(jié)合形成異源二聚體，阻止Bax同源二聚體的形成，抑制Bax的促凋亡作用[13]。當受到凋亡刺激時，Bad以其自身的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-xL結(jié)合，使得原來與Bcl-xL相結(jié)合的Bax釋放出來，Bax形成同源二聚體并插入線粒體外膜，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道的開放[14]，導致細胞色素C的釋放。細胞色素C與Apaf-1結(jié)合，后者同時與死亡效應子前體Caspase-9相互作用形成凋亡小體，活化的Caspase-9繼而活化下游的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修復酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，從而使核DNA不可復性損傷，最終導致細胞凋亡。正常情況下，Caspase-3蛋白酶以無活性的前體形式定位在胞漿中，只有當細胞凋亡時才被切割激活為有活性的Caspase-3，因此，本實驗用抗active-Caspase-3抗體作免疫印跡分析，檢測胞漿中切割后Caspase-3的活性片段。

總之，本實驗證實了腦缺血復灌過程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，干擾了Bad與14-3-3結(jié)合，Bad轉(zhuǎn)位到線粒體，誘導神經(jīng)元凋亡。因此，JNK介導的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。Bad磷酸化狀態(tài)是決定細胞存活或是死亡命運的關(guān)鍵性因素之一，Bad也許會成為預防和治療缺血性腦中風的一個新的藥物作用靶點。

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[12] 李建民，趙雅寧，劉樂等. SP600125抑制JNK信號通路對高血壓全腦缺血模型大鼠海馬區(qū)CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白表達的影響[J]. 中華高血壓雜志，2013，21（6）：553-558.

[13] 丁黎敏，黃小民，張微，等. 原花青素通過對Caspase-3和Bcl-xl、Bax蛋白的調(diào)節(jié)抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2013，31（3）：582-584.

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（收稿日期：2014-08-18）

接著，我們檢測到：與缺血復灌組相比，SP600125組Bad與14-3-3的結(jié)合明顯增高，Bad與Bcl-Xl的結(jié)合、Caspase-3蛋白表達顯著減少。結(jié)果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后干擾了Bad與14-3-3的結(jié)合，Bad隨后與14-3-3分離，轉(zhuǎn)位到線粒體外膜與Bcl-Xl結(jié)合，促進了線粒體內(nèi)凋亡因子的釋放，進而誘導神經(jīng)元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以會誘導Bad線粒體轉(zhuǎn)位，可能是由于Bad絲氨酸128位與絲氨酸136位在空間構(gòu)型上比較接近，絲氨酸128位磷酸化修飾從空間構(gòu)型上干擾了絲氨酸136位與14-3-3的相互作用[4]。然而，絲氨酸128位磷酸化也可能是通過與其他蛋白相互作用，破壞了14-3-3與磷酸化的絲氨酸136位的結(jié)合[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常細胞內(nèi)，Bcl-xL與Bax結(jié)合形成異源二聚體，阻止Bax同源二聚體的形成，抑制Bax的促凋亡作用[13]。當受到凋亡刺激時，Bad以其自身的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-xL結(jié)合，使得原來與Bcl-xL相結(jié)合的Bax釋放出來，Bax形成同源二聚體并插入線粒體外膜，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道的開放[14]，導致細胞色素C的釋放。細胞色素C與Apaf-1結(jié)合，后者同時與死亡效應子前體Caspase-9相互作用形成凋亡小體，活化的Caspase-9繼而活化下游的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修復酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，從而使核DNA不可復性損傷，最終導致細胞凋亡。正常情況下，Caspase-3蛋白酶以無活性的前體形式定位在胞漿中，只有當細胞凋亡時才被切割激活為有活性的Caspase-3，因此，本實驗用抗active-Caspase-3抗體作免疫印跡分析，檢測胞漿中切割后Caspase-3的活性片段。

總之，本實驗證實了腦缺血復灌過程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，干擾了Bad與14-3-3結(jié)合，Bad轉(zhuǎn)位到線粒體，誘導神經(jīng)元凋亡。因此，JNK介導的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。Bad磷酸化狀態(tài)是決定細胞存活或是死亡命運的關(guān)鍵性因素之一，Bad也許會成為預防和治療缺血性腦中風的一個新的藥物作用靶點。

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[14] Ding J， Mooers BH， Zhang Z， et al. After embedding in membranes antiapoptotic Bcl-XL protein binds both Bcl-2 homology region 3 and helix 1 of proapoptotic Bax protein to inhibit apoptotic mitochondrial permeabilization[J]. J Biol Chem， 2014，289（17）：11873-11896.

（收稿日期：2014-08-18）

接著，我們檢測到：與缺血復灌組相比，SP600125組Bad與14-3-3的結(jié)合明顯增高，Bad與Bcl-Xl的結(jié)合、Caspase-3蛋白表達顯著減少。結(jié)果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后干擾了Bad與14-3-3的結(jié)合，Bad隨后與14-3-3分離，轉(zhuǎn)位到線粒體外膜與Bcl-Xl結(jié)合，促進了線粒體內(nèi)凋亡因子的釋放，進而誘導神經(jīng)元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以會誘導Bad線粒體轉(zhuǎn)位，可能是由于Bad絲氨酸128位與絲氨酸136位在空間構(gòu)型上比較接近，絲氨酸128位磷酸化修飾從空間構(gòu)型上干擾了絲氨酸136位與14-3-3的相互作用[4]。然而，絲氨酸128位磷酸化也可能是通過與其他蛋白相互作用，破壞了14-3-3與磷酸化的絲氨酸136位的結(jié)合[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常細胞內(nèi)，Bcl-xL與Bax結(jié)合形成異源二聚體，阻止Bax同源二聚體的形成，抑制Bax的促凋亡作用[13]。當受到凋亡刺激時，Bad以其自身的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-xL結(jié)合，使得原來與Bcl-xL相結(jié)合的Bax釋放出來，Bax形成同源二聚體并插入線粒體外膜，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道的開放[14]，導致細胞色素C的釋放。細胞色素C與Apaf-1結(jié)合，后者同時與死亡效應子前體Caspase-9相互作用形成凋亡小體，活化的Caspase-9繼而活化下游的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修復酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，從而使核DNA不可復性損傷，最終導致細胞凋亡。正常情況下，Caspase-3蛋白酶以無活性的前體形式定位在胞漿中，只有當細胞凋亡時才被切割激活為有活性的Caspase-3，因此，本實驗用抗active-Caspase-3抗體作免疫印跡分析，檢測胞漿中切割后Caspase-3的活性片段。

總之，本實驗證實了腦缺血復灌過程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，干擾了Bad與14-3-3結(jié)合，Bad轉(zhuǎn)位到線粒體，誘導神經(jīng)元凋亡。因此，JNK介導的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。Bad磷酸化狀態(tài)是決定細胞存活或是死亡命運的關(guān)鍵性因素之一，Bad也許會成為預防和治療缺血性腦中風的一個新的藥物作用靶點。

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（收稿日期：2014-08-18）