焦永吉，王悶靈，趙云波，趙世民，張涵，蔣士君

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,鄭州市文化路95號450002；

2 河南省煙草公司洛陽市公司,洛陽市開元大道246號471000；

3 河南省洛陽市煙草公司宜陽分公司,洛陽市宜陽縣紅旗中路32號471600；

4 河南省洛陽市煙草公司汝陽分公司,洛陽市汝陽縣人民路41號471200

植物保護(hù)

河南省煙草根結(jié)線蟲種類的PCR鑒定與種群分析

焦永吉1，王悶靈2，趙云波3，趙世民2，張涵4，蔣士君1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,鄭州市文化路95號450002；

2 河南省煙草公司洛陽市公司,洛陽市開元大道246號471000；

3 河南省洛陽市煙草公司宜陽分公司,洛陽市宜陽縣紅旗中路32號471600；

4 河南省洛陽市煙草公司汝陽分公司,洛陽市汝陽縣人民路41號471200

為明確河南省煙田根結(jié)線蟲種群分布及比例,采集了12份煙草根結(jié)線蟲樣本。通過對線蟲樣本的PCR分子檢測和雌成蟲會陰花紋的形態(tài)鑒定,結(jié)果表明,檢出煙草根結(jié)線蟲4種,其中南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）檢出率為55.83%,花生根結(jié)線蟲（Meloidogyne arenaria）23.33% ,北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla）17.50% ；爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica）3.33%。種群分析表明河南地區(qū)仍以南方根結(jié)線蟲為主,同時其他種類根結(jié)線蟲的發(fā)生危害比例在上升。所有樣本均為混合侵染,南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲在河南廣泛分布,具有普遍性；爪哇根結(jié)線蟲在河南分布沒有規(guī)律性。

根結(jié)線蟲；PCR分子檢測；會陰花紋鑒定

世界范圍內(nèi)為害煙草的線蟲主要有根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）、 胞 囊 線 蟲（Heterodrasp.）和根腐線蟲（Paratylenchusspp.）三大類[1],引起溫帶和亞熱帶煙草較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中根結(jié)線蟲（root-knot nematode）是煙草上最重要、最常見的有害線蟲之一[2],是世界各國煙草生產(chǎn)中重要病害之一,也是當(dāng)前在我國煙草發(fā)生范圍最廣、為害最重、防治難度大的線蟲。根結(jié)線蟲相比其他植物病原——真菌、細(xì)菌、病毒等,具有主動侵襲寄生和自行轉(zhuǎn)移為害的特點,此外,還能與有些病原真菌、細(xì)菌、病毒互作,共同致病造成復(fù)合病害,或以刺激、誘導(dǎo)、傳帶等協(xié)同方式促進(jìn)這三種病害的加重,可以說,線蟲具有雙重性病原的特點[3]。據(jù)據(jù)2002年的我國煙草業(yè)統(tǒng)計,全國根結(jié)線蟲發(fā)生面積為10.83萬公頃,直接為害所造成的煙葉經(jīng)濟(jì)損失7917.84萬元,占侵染性病害所致?lián)p失的5.7%[4]。

當(dāng)前河南省大多數(shù)煙田為旱坡地輕砂質(zhì)土或砂壤土,且多年連續(xù)種煙,難以實行水旱輪作、冬灌以及與其他作物的輪作倒茬,加之高抗線蟲病煙草品種的缺乏、全球性氣候變暖以及我國冬季的多樣性種植,作物線蟲病的發(fā)生已呈持續(xù)加重之勢,并造成了許多復(fù)合病害或繼發(fā)感染,已成為制約煙草生產(chǎn)的嚴(yán)重障礙。

本研究采用PCR分子檢測法,結(jié)合根結(jié)線蟲會陰花紋形態(tài)觀察法對采自河南省主產(chǎn)煙區(qū)8個縣12份煙草根結(jié)線蟲樣品進(jìn)行了鑒定,旨在明確當(dāng)前河南煙區(qū)根結(jié)線蟲的種群分布,為科學(xué)制定河南煙草根結(jié)線蟲的防治規(guī)劃和抗線蟲病育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2012年,根據(jù)煙葉生產(chǎn)中根結(jié)線蟲的發(fā)生情況,在河南省煙區(qū)選擇了具有代表性的8個煙葉生產(chǎn)重點縣進(jìn)行了根結(jié)線蟲病調(diào)查。每地塊或0.0667～0.333 hm2小區(qū)內(nèi)取1個混合樣,包括5個小樣。這5個小樣分別采自五點法選定的5株煙草。樣品信息見表1。

表1 本研究中的煙草根結(jié)線蟲樣本來源信息Tab.1 Source information of sample tobacco root-knot nematode

1.2 根結(jié)線蟲基因組DNA的提取

采用CTAB法略做改進(jìn)。將清洗過的根結(jié)剪碎混勻,取1 g置于玻璃勻漿器中,加入2 mL的預(yù)熱65℃的2 % CTAB抽提緩沖液,充分研磨勻漿,將勻漿液分倒入1.5 mL的滅菌離心管中,勻漿液的高度約占管的三分之二,將離心管置于65 ℃的金屬浴中,每隔10 min輕輕搖動,40 min后取出,冷卻后,加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管,上下顛倒振蕩2～3 min,使兩者混合均勻,10,000 rpm×10 min,與此同時,將600 μL的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中,移液器輕輕地吸取上清夜,轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi),將離心管慢慢上下?lián)u動30 s,使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物,10,000 rpm×1 min后,立即倒掉上清液,再加入800 uL75%的乙醇,將DNA洗滌30 min,10,000 rpm×30 s后,立即倒掉液體,將離心管放在75 ℃的水浴中使酒精揮發(fā),當(dāng)沒有酒精氣味時取出加入80 μL TE溶解,–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

研究采用的25 uL PCR反應(yīng)體系如下：線蟲模板DNA 1 μL,上下游引物（20 μM）各1 μL,2×TaqMasterMix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。試驗所用引物有4組,基本信息見表2。

PCR 擴(kuò)增條件為 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s,61 ℃30 s,72 ℃ 60 s (DjF/DjR為90 s) ,40個循環(huán),72 ℃10 min,設(shè)置無任何DNA的模板為陰性對照。PCR擴(kuò)增后,取8 uL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用1×TAE緩沖液在100 V下電泳40 min,EB染色15 min,紫外燈下觀察并照相。

表2 本研究中的PCR引物序列信息Tab.2 Sequence infomation of primers

1.4 會陰花紋的制作及觀察

用挑針在體視顯微鏡下解剖根結(jié),隨機(jī)挑取不同側(cè)根上的成熟雌成蟲,每個種群挑取20條移入硬塑料板上清水滴中,用單面刀片或解剖刀切下線蟲尾部,用解剖針慢慢移走其它蟲體和碎片,修剪尾部表皮成方塊狀,使會陰花紋處于方塊中央,清水中清洗3次,把會陰部移到滴有一滴清水的載玻片上,加蓋玻片。在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照,參照文獻(xiàn)[9-11]進(jìn)行分類鑒定,統(tǒng)計各個種所占比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于PCR的鑒定結(jié)果

M MC1 MC2 LN YY1 YY2 RY1 RY2 RY3 XC XX JX QS N

圖1 南方根結(jié)線蟲引物對（A）、花生根結(jié)線蟲引物對（B）、北方根結(jié)線蟲引物對（C）、爪哇根結(jié)線蟲引物對（D）擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplifications with primer sets MiSF／MiSD(A),Far／Rar(B),Mh-F/Mh-R(C) and DjF/DjR(D)

根據(jù)南方根結(jié)線蟲特異性引物MiSF／MiSD對供試線蟲種群的PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1A)表明,所有12份檢樣均擴(kuò)增出了502 bp長的目標(biāo)DNA片段,說明所有檢樣中均有南方根結(jié)線蟲（M.incognita）存在。

花生根結(jié)線蟲特異性引物Far／Rar對供試線蟲種群的PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1B)表明,來自澠池、洛寧、宜陽、許昌、襄城縣、郟縣、確山等7縣的9份檢樣中均擴(kuò)增出420 bp長的目標(biāo)DNA片段,表明了檢樣中存在花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）。

北方根結(jié)線蟲特異性引物Mh-F/Mh-R對供試線蟲種群的PCR擴(kuò)增（圖1C)表明,所有檢樣均擴(kuò)增出462 bp長的目標(biāo)DNA片段,說明所有12份檢樣中均有北方根結(jié)線蟲（M.hapla）存在。

利用爪哇根結(jié)線蟲特異性引物DjF/DjR進(jìn)行的PCR擴(kuò)增（圖1D)表明,僅有來自澠池、洛寧、宜陽、許昌、郟縣等5縣的6份檢樣擴(kuò)增出了爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）的1650 bp目標(biāo)片段。

2.2 基于會陰花紋的形態(tài)鑒定結(jié)果

基于雌成蟲會陰花紋特征的鑒定結(jié)果列于表3。可以清晰看到,來自豫西煙區(qū)的澠池、洛寧、宜陽和來自豫中煙區(qū)的許昌、郟縣的檢樣中四種根結(jié)線蟲都存在；來自豫南確山的檢樣中存在三種根結(jié)線蟲（M.incognita、M.arenaria、M.hapla）；但同樣來自豫西煙區(qū)的汝陽3份檢樣中僅存在兩種根結(jié)線蟲（M.incognita、M.hapla）。所檢樣本均為混合侵染。

比較PCR鑒定結(jié)果與會陰花紋形態(tài)鑒定結(jié)果（表3）,可以看出兩種方法的鑒定結(jié)果一致,說明基于PCR的根結(jié)線蟲種類鑒定比較可靠,且省工省時。但我們認(rèn)為PCR法比較適于種類的定性檢測與鑒定,會陰花紋法比較適于種群構(gòu)成的定量分析。

圖2 光學(xué)顯微鏡下南方根結(jié)線蟲（A）、花生根結(jié)線蟲(B)、北方根結(jié)線蟲(C)、爪哇根結(jié)線蟲(D)的會陰花紋形態(tài)Fig.2 Photographs of perineal patterns of M.incognita (A), M.arenaria (B）, M.hapla (C）,M.javanica (D）LM

研究結(jié)果還表明,南方根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲普遍存在于河南省煙田土壤中,花生根結(jié)線蟲存在于汝陽煙區(qū)之外的所有煙田,而爪哇根結(jié)線蟲僅局部分布,但看不出其分布的規(guī)律性。種群構(gòu)成上,南方根結(jié)線蟲是河南省煙草根結(jié)線蟲的優(yōu)勢種群,平均檢出率達(dá)55.83 %,其次為花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲,分別占23.33 %和17.50 %,而爪哇根結(jié)線蟲比例最小,僅占3.33 %。盡管來自不同地區(qū)的根結(jié)線蟲種群數(shù)量存在著差異,如汝陽煙田僅檢出南方根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲等兩種根結(jié)線蟲,但看不出種群分布與地理來源之間的相關(guān)性,且同一地區(qū)的各種根結(jié)線蟲所占比例也存在著差異。

表3 根結(jié)線蟲樣本的PCR鑒定和會陰花紋鑒定結(jié)果比較Tab.3 Identification of tobacco RKN samples by PCR-based method and perineal pattern-based method

3 結(jié)論與討論

了解根結(jié)線蟲病病原種類是培育和選用抗病品種的基礎(chǔ)。手段多元化是根結(jié)線蟲分類上的一個顯著特點[12]。用于根結(jié)線蟲的分類手段常見的有傳統(tǒng)方法（包括形態(tài)學(xué)鑒定方法、鑒別寄主輔助鑒別實驗、細(xì)胞遺傳學(xué)方法和同工酶電泳技術(shù)）和現(xiàn)代分子生物技術(shù)（RFLP、 AFLP、RAPD、SCAR等）。本研究采用PCR技術(shù)與形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法,對河南煙區(qū)的根結(jié)線蟲種類進(jìn)行了定性分析和流行學(xué)調(diào)查。

朱賢朝等[1]曾對河南省煙草根結(jié)線蟲病進(jìn)行了報道,認(rèn)為河南省煙草上存在南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲4種根結(jié)線蟲,其中南方根結(jié)線蟲占83.3 %。李淑君等[13]曾對河南省煙草根結(jié)線蟲病進(jìn)行了初步研究,認(rèn)為河南省煙草上存在南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、高弓根結(jié)線蟲5種根結(jié)線蟲；南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲是河南的優(yōu)勢種。海飛[14]曾對河南省的經(jīng)濟(jì)作物根結(jié)線蟲種類作了初步鑒定,認(rèn)為南方根結(jié)線蟲是河南地區(qū)最大的優(yōu)勢種群,在鑒定標(biāo)本中出現(xiàn)頻率為47.22%,花生根結(jié)線蟲是次優(yōu)勢種群,在鑒定標(biāo)本中出現(xiàn)頻率為36.11%,南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合侵染的比例為l1.1l%,北方根結(jié)線蟲的出現(xiàn)頻率為5.5%,未發(fā)現(xiàn)爪哇根結(jié)線蟲。

本研究采樣的8個縣分布在豫西、豫中、豫南,所得結(jié)果有較好的代表性。由鑒定結(jié)果看,在河南省南方根結(jié)線蟲約占55.83 %,花生根結(jié)線蟲約占23.33 %,北方根結(jié)線蟲約占17.50 %,爪哇根結(jié)線蟲約占3.33 %。河南省仍以南方根結(jié)線蟲占優(yōu)勢,花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲的危害也較為嚴(yán)重,形態(tài)鑒定和分子鑒定均鑒定到爪哇根結(jié)線蟲的存在,所有樣本均為混合侵染,南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲在河南省的分布具有普遍性,而爪哇根結(jié)線蟲在河南省分布沒有規(guī)律性。調(diào)查結(jié)果與朱賢朝報道的結(jié)果相比,南方根結(jié)線蟲的比例有很大的下降,這可能與單抗南方根結(jié)線蟲煙草品種的長期種植有關(guān)。調(diào)查結(jié)果與海飛[14]的調(diào)查結(jié)果相比,南方根結(jié)線蟲有所上升,花生根結(jié)線蟲有所下降,這可能與海飛的樣品中煙草根樣所占比例（≤10 %）有關(guān)；同時也與煙草的輪作制度有關(guān)——不同的輪作作物對線蟲的抗感性不同,如在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)汝陽大面積種植花生,由鑒別寄主試驗可知只有花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲侵染花生,而當(dāng)?shù)刂淮嬖谀戏礁Y(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲,當(dāng)?shù)責(zé)煵菖c花生輪作必然會引起北方根結(jié)線蟲比例上升,導(dǎo)致汝陽地區(qū)北方根結(jié)線蟲所占比例明顯高于其他地方。調(diào)查結(jié)果與海飛[14]的調(diào)查結(jié)果相比所有樣品均為混合侵染,這可能與樣品的采集地點有關(guān)。本研究采用大田取樣,環(huán)境相對開放,利于線蟲種群交流,因此線蟲病害多為混發(fā)；而海飛[12]調(diào)查的瓜果蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物多為設(shè)施地栽培,環(huán)境相對孤立、封閉,不利于線蟲種群交流,因此多為單一物種危害。

本研究反映了河南一些煙草生產(chǎn)地區(qū)根結(jié)線蟲的種群分布情況,有利于進(jìn)一步了解根結(jié)線蟲的動態(tài)變化,對于線蟲病的防治工作和煙草抗線蟲病育種工作的開展起到了一定的促進(jìn)作用。由于我國煙區(qū)分布廣泛、生態(tài)條件復(fù)雜,為害煙草的線蟲情況不盡相同,仍需做大量基礎(chǔ)的調(diào)查研究工作。由于時間的局限性本實驗未進(jìn)行鑒別寄主試驗以明確到生理小種,同時擴(kuò)增片段DNA的測序及種群親緣關(guān)系分析等后續(xù)工作也有待進(jìn)行。

[1]朱賢朝,王彥亭,王智發(fā).中國煙草病害[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[2]Webster J M.經(jīng)濟(jì)線蟲學(xué)[M].胡起宇,譯.北京：農(nóng)業(yè)出版社, 1988.

[3]馮志新.植物線蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

[4]中國煙葉生產(chǎn)購銷公司.中國煙葉生產(chǎn)使用技術(shù)指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003.

[5]B.TESA?OVá, et al.Development of PCR for specific determination of root-knot nematode meloidogyne incognita[J].Plant Protect Sci,2003,39(1): 23-28.

[6]Zijlstra, et al, Identification of meloidogyne incognita, M.javanica and M.arenaria using sequence characterised amplified region (SCAR) based PCR assays[J].Nematology, 2000,2(8):847-853.

[7]馮光泉,董麗英,陳昱君,等.三七病原根結(jié)線蟲的分子鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 21(1):100-102.

[8]Dong K, Dean R A, Fortnum B A, et al.Development of pcr primers to identify species of root-knot nematodes:meloidogyne arenaria, m.hapla, m.incognita and m.javanica[J].Nematropica,.2001, 31(2):271-280.

[9]劉維志.植物線蟲志[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2004.

[10]Roland N Perry, Maurice Moens, James L.Starr.Root knot nematodes[M].CABI, 2009.

[11]Eisenback J D.四種最常見根結(jié)線蟲分類指南[M].楊寶君,譯.昆明：云南人民出版社,1986.

[12]武揚(yáng).根結(jié)線蟲分類和鑒定途徑及進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 , 2005, 17(2)：106-110.

[13]李淑君.河南省煙草根結(jié)線蟲病初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1991(5):16-18.

[14]海飛.河南經(jīng)濟(jì)作物根結(jié)線蟲病的為害調(diào)查與種類鑒定[J].長江蔬菜, 2011(24):65-67.

PCR-based identification of root-knot nematodes (Meloidogynespp)in tobacco in Henan province

JIAO Yongji1, WANG Menling2,ZHAO Yunbo3,ZHAO Shimin2,ZHANG Han4, JIANG Shijun1
1 College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
2 Henan Luoyang Tobacco Company, Luoyang 471000, China;
3 Yiyang Branch, Henan Luoyang Tobacco Company, Yiyang 471600, China;
4 Ruyang Branch, Henan Luoyang Tobacco Company, Ruyang 471200, China

Root-knot nematode is one of the most important diseases in tobacco in Henan province.12 samples were collected from 8 counties from main tobacco planting areas.Perineal pattern-based morphological and PCR-based molecular identification revealed that 4 species ofMeloidogynewere detected.of whichM.incognitaaccounted for 55.83%,M.arenaria23.33%,M.hapla17.50% andM.javanica3.33%.Meloidogyne incognitawas dominant although other species in the pathogen population of tobacco root-knot nematode were increasing.All samples showed mixed infection.M.incognita, M.arenariaandM.haplawere very common and widely distributed in Henan whileM.javanicadistributed unevenly.

root-knot nematode (Meloidogynespp.）；PCR molecular detection； perineal pattern identification

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.013

S435.72; Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0079-05

中國煙草總公司項目“全國煙草有害生物調(diào)查研究”（110200902065）

焦永吉（1988—）,碩士研究生,從事線蟲病害研究,Email：jiaoyongji@126.com

蔣士君（1964—）,副教授,主要從事煙草病理學(xué)研究,Email：jiangsj001@163.com

2013-05-14