周誼芬，董玉林

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，江蘇226001）

骨髓基質(zhì)細(xì)胞（marrow stromal cells,MSCs）是一種廣泛存在于骨髓組織中而非造血的實(shí)質(zhì)干細(xì)胞[1-2]。目前研究結(jié)果顯示，在一定條件下，嚙齒類MSCs能夠向神經(jīng)元、心肌細(xì)胞和其它類型的細(xì)胞分化[3]，被認(rèn)為是最有臨床應(yīng)用前景的干細(xì)胞來(lái)源之一[4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SD大鼠的MSCs進(jìn)行了體外分離培養(yǎng)，為進(jìn)一步研究MSCs的分化潛能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試驗(yàn)動(dòng)物：SD普通大鼠4只，清潔級(jí)，體重為225～275g，雌雄不拘，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。（2）試劑：IMDM培養(yǎng)基及胎牛血清FBS（GIBCO 公司）。

1.2 方法 （1）MSCs分離、純化、擴(kuò)增：取SD普通大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，麻醉后，75%乙醇浸泡30 min，移至超凈工作臺(tái)上，剔除大鼠兩側(cè)的雙下肢毛發(fā)，2%碘酊消毒，75%乙醇脫碘2次。嚴(yán)格無(wú)菌操作下解剖并取大鼠兩側(cè)的雙下肢，剪除軟組織，分離股骨。除去股骨的骨骺段，暴露兩端的骨髓腔，用含10%FBS的IMDM完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔。收集沖洗液于無(wú)菌離心管中，得到細(xì)胞懸液，室溫下1 000 r/min離心5 min。離心后離心管內(nèi)的細(xì)胞懸液分層，倒掉上清液，加入含10%FBS的IMDM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，充分吹打形成單細(xì)胞懸液。接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱，用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)MSCs。48 h后全部更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3～4 d更換新鮮培養(yǎng)液。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，1∶1傳代培養(yǎng)。（2）MSC的傳代培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%以上時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，DHank液漂洗細(xì)胞3次，用0.25%胰蛋白酶均勻覆蓋細(xì)胞表面，37℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱放置1～3min。倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞開(kāi)始皺縮成球形。當(dāng)開(kāi)始懸浮時(shí)，立即加含10%FBS的IMDM完全培養(yǎng)液終止消化。并用吸管輕輕地反復(fù)吹打，使瓶壁上的細(xì)胞脫落，形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.6×105/mL，接種于24孔板，每孔500 μL。待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)50%～60%時(shí)，用PBS輕輕漂洗3次后，用4%多聚甲醛固定1 h，然后再用PBS輕輕漂洗3次。（3）體外培養(yǎng)MSCs的顯微鏡觀察：倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征，并拍照。

2 結(jié) 果

原代MSCs接種后24 h內(nèi)，細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)增殖。48 h后全部更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3～4 d更換新鮮培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，1∶1傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種后24 h內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形或扁平形（圖1A）。48 h后貼壁細(xì)胞沿培養(yǎng)瓶壁伸展開(kāi)，圓形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞壁完整，胞核隱約可見(jiàn)，胞質(zhì)豐富（圖1B）。傳至第5代的MSCs純度高，增殖能力旺盛，呈梭形或紡錘形的細(xì)胞，呈漩渦狀、菊花狀排列生長(zhǎng)（圖1C、D）。

圖1 MSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)特點(diǎn)

3 討 論

目前對(duì)人、兔、猴、大鼠等不同種屬的MSCs進(jìn)行培養(yǎng)顯示[5]，在研究過(guò)程中其取材部位及方式等各有不同。在本實(shí)驗(yàn)中我們選用了來(lái)源豐富、取材方便[6]的SD清潔大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，取大鼠雙下肢股骨。用含10%FBS的IMDM完全培養(yǎng)液對(duì)骨髓腔進(jìn)行沖洗，以獲得骨髓組織，此操作方法對(duì)骨髓中的細(xì)胞成分損傷小。

常用于分離MSCs的方法有4種[7]：密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法。密度梯度離心法是根據(jù)骨髓中各種細(xì)胞成分比重的不同，用Percoll分離液將MSCs分離出來(lái)。貼壁篩選法主要是根據(jù)MSCs的高度粘附特性，在培養(yǎng)過(guò)程中其可以緊密地粘附培養(yǎng)瓶壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)48 h內(nèi)更換培養(yǎng)液去除不能貼壁的細(xì)胞，純化培養(yǎng)的MSCs。過(guò)程操作簡(jiǎn)單，MSCs增殖快，在短期內(nèi)可獲得較多的MSCs，但所得MSCs純度不高。流式細(xì)胞儀分離法是根據(jù)MSCs的胞體小和細(xì)胞無(wú)顆粒來(lái)進(jìn)行細(xì)胞分離的，對(duì)細(xì)胞活性影響較大，所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后易死亡。免疫磁珠法可以能得到純度較高的MSCs，但在實(shí)驗(yàn)中，所需要的試劑和儀器都比較昂貴，不宜于廣泛使用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法，對(duì)分離的MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，所得細(xì)胞增殖旺盛，活力強(qiáng)，隨著培養(yǎng)傳代的不同，細(xì)胞的形態(tài)不同。在倒置顯微鏡下觀察90%以上的MSCs形態(tài)呈梭形或紡錘形的細(xì)胞，呈漩渦狀、菊花狀排列生長(zhǎng)。

[1]劉巧云,易黎.骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)、體外向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展［J］.神經(jīng)損傷與功能重建,2010,5(2):139-142,146.

[2]Li Y,Chopp M.Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury［J］.Neurosci Lett,2009,456(3):120-123.

[3]Sauerzweig S,Munsch T,Lessmann V,et al.A population of serum deprivation-induced bone marrow stem cells (SDBMSC)expresses marker typical for embryonic and neural stem cells［J］.Exp Cell Res,2009,315(1):50-66.

[4]邊穎,何志義.骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠缺血性腦梗死神經(jīng)功能的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志,2010,30(23):3529-3530.

[5]Cornet F,Broux O,Anselme K,et al.Effect of dexamethasone on moesin gene expression in rabbit bone marrow stromal cells［J］.Mol Cell Biochem,2004,265(1/2):79-83.

[6]Parr AM,Tator CH,Keating A.Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury［J］.Bone Marrow Transplant,2007,40(7):609-619.

[7]Gurevich O,Vexler A,Marx G,et al.Fibrin microbeads for isolating and growing bone marrow-derived progenitor cells capable of forming bone tissue［J］.Tissue Eng,2002,8(4):661-672.