古學(xué)文（廣東省廣州市荔灣區(qū)芳村中醫(yī)醫(yī)院 510360）

冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病是影響患者生活質(zhì)量和危及生命安全的重要原因，也是病情進(jìn)展和惡化的重要原因。關(guān)于冠心病（CHD）的發(fā)病機(jī)制，國內(nèi)外已經(jīng)有大量研究從器官、組織、細(xì)胞、分子和基因等不同層面加以闡述，并形成了各種學(xué)說。蛋白激酶C受體蛋白（RACK1）是WD 重復(fù)蛋白家族的重要成員，是一種相對分子質(zhì)量為36000的支架蛋白，呈β－螺旋槳結(jié)構(gòu)狀，廣泛存在于哺乳動物多種組織以及外周血中，可參與調(diào)節(jié)多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［1－2］。蛋白激酶C（PKC）系統(tǒng)又稱為磷脂肌醇信號途徑，功能主要在于對基因進(jìn)行控制和表達(dá)，從而實現(xiàn)控制細(xì)胞膜，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。血管平滑肌細(xì)胞的增生會導(dǎo)致PKC活性增強(qiáng)，而PKC 活性增強(qiáng)在動脈粥樣硬化中有著非常重要的作用，兩者之間的關(guān)系密切。而作為錨定蛋白的RACK1，在冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生過程中是否有著重要的影響，在這方面的研究卻非常少。本研究擬對不同病變程度的冠狀動脈粥樣硬化患者RACK1水平進(jìn)行檢測，以探討冠狀動脈粥樣硬化患者血液中RACK1的表達(dá)情況，從而分析其與冠狀動脈狹窄程度之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇本院2012年3月至2012年10月收治的90例冠狀動脈粥樣硬化患者為研究對象，對所有患者進(jìn)行冠狀動脈造影，根據(jù)美國心臟學(xué)會（ACC）指南中冠狀動脈造影，按照Gensini評分系統(tǒng)將患者分成A、B、C組。其中A組31例患者Gensini評分為1～10分；男17例，女13例；平均年齡（57.6±11.2）歲，病程（2.8±0.5）年。B組30例患者Gensini評分為11～20分；男15例，女14例；平均年齡（59.6±11.9）歲，病程（3.6±0.7）年。C組29例患者Gensini評分大于20分；男17例，女14例；平均年齡（61.2±12.1）歲，病程（4.1±0.8）年。另外選擇同期體檢的30例健康者為健康對照組，其中男18例，女12例；平均年齡（58.2±11.5）歲。4組患者在年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）無急慢性感染性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、腫瘤和結(jié)締組織病等可能影響RACK1的因素；（2）所有研究對象均需簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有嚴(yán)重的肝、腎疾病；（2）患有嚴(yán)重的急性或慢性傳染性疾病及結(jié)締組織疾病等。

1.3 Gensini評分系統(tǒng)根據(jù)冠狀動脈病變的部位評定系數(shù)，冠狀動脈狹窄評分×病變部位的系數(shù)，則可以得出病變評分［3－4］。根據(jù)患者冠狀動脈狹窄程度進(jìn)行評分，25%為1分；50%為2分；75%為4分；90%為8分；99%為16分；100%為32分，得分越高，病變程度越嚴(yán)重。

1.4 方法采用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real－time PCR）檢測RACK1mRNA 水平。引物序列，Trizol試劑，試劑盒，人淋巴細(xì)胞分離液和Rotor－gene 3000實時PCR 儀均為華大基因公司提供。所有患者均采集靜脈血4mL，枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞，加入1mL Trizol，提取外周血總RNA，在提取RNA 后，利用1%瓊漿糖凝膠電泳進(jìn)行驗證和反轉(zhuǎn)錄。用13μL 模板RNA、2μL 模板RNA 在恒溫37℃下孵育1h。反轉(zhuǎn)錄得到RACK1mRNA，之后按照試劑盒說明進(jìn)行實時PCR 擴(kuò)增，目的基因表達(dá)陽性的擴(kuò)增曲線為S型，陰性標(biāo)本為不規(guī)則波浪線。目的基因mRNA 相對表達(dá)量以2－ΔΔCt表示，其中ΔCt＝樣本Ct均值－內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt＝ΔCt－（陰性對照樣品Ct均值－樣品內(nèi)參Ct均值）。對RACK1 mRNA 表達(dá)水平檢測進(jìn)行檢測，檢測試劑主要由美國invitrogen公司提供，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為138～140bp。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS12.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)r檢驗，以α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨著RACK1mRNA 的增高，Gensini積分也相應(yīng)增高，各組間RACK1 mRNA 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。將RACK1mRNA 水平和Gensini積分進(jìn)行等級資料相關(guān)性分析，結(jié)果顯示RACK1 mRNA 水平與Gensini積分呈顯著正相關(guān)（r＝0.483，P＜0.01）。Gensini積分為不連續(xù)變量，兩者的相關(guān)性以Spearman等級顯示。冠狀動脈粥樣硬化患者外周血RACK1mRNA 表達(dá)量與冠脈狹窄程度存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)rs＝0.57（P＜0.01）。

表1 4組RACK1mRNA 水平和Gensini積分統(tǒng)計（）

表1 4組RACK1mRNA 水平和Gensini積分統(tǒng)計（）

注：與健康對照組比較，aP＜0.01；與A組比較，b P＜0.01；與B組比較，c P＜0.01。

3 討論

目前較為流行的冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制有平滑肌突變學(xué)說、內(nèi)皮損傷學(xué)說、脂質(zhì)滲入學(xué)說、炎癥學(xué)說和單核－巨噬細(xì)胞作用學(xué)說等［5－6］。除了上述的發(fā)病機(jī)制之外，普遍認(rèn)為人體的其他因素也可以參與到動脈粥樣硬化當(dāng)中，其中包括人體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、細(xì)胞異常增殖和凋亡、細(xì)胞基質(zhì)失調(diào)等。本研究主要從RACK1分子基因水平研究其與冠狀動脈粥樣硬化的關(guān)系。

PKC是G 蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，可促進(jìn)細(xì)胞的生長、分裂和代謝，也可與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白相互作用［7］。其在非活性狀態(tài)下是水溶性的，游離存在于胞質(zhì)溶膠中；激活后是脂依賴性的，需要膜脂1，2－甘油二脂（DAG）的存在，同時又是Ca2＋依賴的，需要胞質(zhì)溶膠中高Ca2＋濃度。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，PKC以Ca2＋依賴的形式從胞漿中移位到細(xì)胞膜上，醫(yī)學(xué)中以此作為PKC激活的標(biāo)志［8］。此外，PKC 能夠與其他激酶催化產(chǎn)生反應(yīng)，激活Na＋－K＋交換系統(tǒng)，從而提高細(xì)胞質(zhì)的pH值。PKC升高可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增生和分化，炎癥水平增高，免疫水平下降，心肌細(xì)胞膜功能改變，在動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮重要作用。

RACK1是哺乳動物中PKC的重要受體，廣泛分布于多種組織器官中。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物中有80多種蛋白與RACK1相互作用，如酪氨酸激酶、PKC、胰島素樣生長因子Ⅰ等［9］。RACK1作為一種錨定蛋白可以和細(xì)胞中的信號分子結(jié)合，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的分裂、凋亡活動。本研究擬探討與PKC 關(guān)系密切的RACK1水平的增高，是否與冠狀動脈粥樣硬化病變程度有關(guān)。但RACK1水平難以直接測定，因此間接檢測RACK1mRNA 水平。由于冠狀動脈粥樣硬化病變程度與動脈狹窄和病變部位有關(guān)，可采用Gensini積分來表示冠狀動脈粥樣硬化的病變程度。

本研究結(jié)果顯示，冠狀動脈粥樣硬化患者外周血中的RACK1mRNA 水平明顯高于健康對照組（P＜0.01），說明RACK1在冠狀動脈粥樣硬化患者外周血中表達(dá)上調(diào)。此外，冠狀動脈粥樣硬化患者外周血RACK1mRNA 表達(dá)水平與冠狀動脈狹窄程度有著密切關(guān)系（r＝0.483，P＜0.01）。說明RACK1直接參與到冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生中，但其具體發(fā)生機(jī)制卻尚未明確，有可能上述關(guān)鍵酶活性的不斷增高，從而進(jìn)一步激發(fā)機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷等不良情況，最終導(dǎo)致了動脈粥樣硬化的發(fā)生［10－11］。

綜上所述，RACK1水平與冠狀動脈粥樣硬化病變程度有重要影響，對尋找靶位點進(jìn)行針對性基因治療具有積極的參考意義。此外，RACK1是否受其他基因調(diào)節(jié)，是病變導(dǎo)致RACK1水平增高，還是不同患者本身遺傳的RACK1水平有差異，從而導(dǎo)致發(fā)病率、病變程度、進(jìn)度等的不同，還有待進(jìn)一步研究。

［1］Wang Z，Jiang L，Huang C，et al.Comparative proteomics approach to screening of potential diagnostic and therapeutic targets for oral squamous cell carcinoma［J］.Mol Cell Protomics，2008，68（7）：1639－1650.

［2］雷玉平，管軍，郭亮，等.冠狀動脈粥樣硬化患者外周血蛋白激酶C受體蛋白表達(dá)與冠狀動脈狹窄的關(guān)系［J］.中國心血管雜志，2012，17（4）：264－267.

［3］劉歌.冠心病合并室性心律失常108例臨床分析［J］.醫(yī)學(xué)信息：中旬刊，2011，3（7）：3275.

［4］朱蘇航，金積昌，賈連旺.動態(tài)心電圖監(jiān)測評價可達(dá)靈片治療冠心病無癥狀心肌缺血的療效［C］／／第十次中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會心血管病學(xué)術(shù)大會暨第五次江西省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會心血管病學(xué)術(shù)大會論文匯編，2010：120－121.

［5］劉丹，郭曉玲.冠狀動脈粥樣硬化性心臟病與炎癥及免疫系統(tǒng)關(guān)系的研究［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，13（8）：1138－1139.

［6］Gensini GG.A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary heart disease［J］.Am J Cardiol，1983，51（3）：606.

［7］Zakrzewicz A，Hecker M，Marsh LM，et al.Receptor for activated C－kinase 1，a novel interaction partner of type II bone morphogenetic protein receptor，regulates smooth muscle cell proliferation in pulmonary arterial hypertension［J］.Circulation，2007，115（23）：2957－2968.

［8］劉軍鋒，王雪艷，賈克剛，等.冠狀動脈旁路移植術(shù)后血栓形成和再狹窄影響因素的研究現(xiàn)狀［J］.中華老年心腦血管病雜志，2012，14（6）：660－662.

［9］賈薇，袁中華.動脈粥樣硬化中的4個PKC 相關(guān)酶［J］.中國病理生理雜志，2007，23（7）：1442－1445.

［10］陳文一，王紅巧，張豐雪.冠心病病人血清IMA 與sICAM－1變化及意義［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，13（6）：517－518.

［11］孫健玲，黃衛(wèi)民，王崇禹，等.冠狀動脈心肌橋與冠狀動脈粥樣硬化關(guān)系的臨床研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，3（29）：57－58.