劉愛軍 陳杏曄 廣州中醫(yī)藥大學組胚教研室（廣州510006）

△廣州中醫(yī)藥大學2012級研究生（廣州510006）

皮膚覆蓋在人體表面，在日常生活中極易受到損傷，毛囊真皮的成纖維細胞（fibroblast）能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN（fibronectin）等ECM成分和堿性成纖維細胞生長因子（base fibroblast growth factor，bFGF）、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種細胞因子，能促進各種生長因子的分泌，誘導皮膚表皮細胞的增殖和遷移，促進皮膚創(chuàng)面的完整修復。七厘散是著名的傷科常用中成藥，本項目組前期研究證明七厘散能促進創(chuàng)面成纖維細胞分泌膠原纖維，促進新生毛細新生，修復表皮和毛囊，但中藥促進皮膚愈合的作用機理并不清楚。本文通過探討七厘散含藥血清對分離培養(yǎng)的SD乳鼠觸須部毛囊真皮根鞘細胞增殖的影響，為更加深入的研究中藥促進細胞增殖和分化的分子機制；尋找切實、有效的藥物作用靶點奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生3d的SD乳鼠（雌雄不拘），用于取觸須部毛囊。雄性SD大鼠（質量180－200g），用于制備含藥血清。以上實驗動物均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 HG－DMEM培養(yǎng)（美國Gibco公司）；優(yōu)質胎牛血清（FBS）（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；青霉素/鏈霉素（Hyclone公司）；0.01mmol/L PBS（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；RT－2100C酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；Ⅰ抗：層黏連蛋白（Laminin，LN）、纖黏連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、波形蛋白（Vimentin）（均購自武漢博士德試劑公司）；Ⅱ抗IgG、SABC－Cy3試劑盒（武漢博士德試劑公司）；核熒光標記物DAPI（美國Sigma公司）。中成藥七厘散（批號：0100033，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）

1.3 方法

1.3.1 SD乳鼠毛囊真皮細胞的獲取 將出生3d的同一胎次的、正常發(fā)育的SD乳鼠10只浸泡于75%酒精中，5min×3次。剪去帶有完整觸須部毛囊的皮膚，雙抗D－Hank’s液洗1次，無雙抗D－Hank’s液洗2次。超凈工作臺內分離出完整的觸須毛囊，均勻置于T25培養(yǎng)瓶，添加少量10%FBS的HGDMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，24h后添加培養(yǎng)基，細胞長滿后按1∶3進行傳代。

1.3.2 細胞爬片的制作 將P2代細胞消化稀釋成細胞懸液，按1×107/L接種于放有消毒蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種1mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長滿蓋玻片50%左右時，取出蓋玻片，0.01mmol/L PBS洗3次，中性甲醛固定30min，0.01mmol/L PBS洗3次。

1.3.3 免疫熒光顯微鏡檢測 P3代毛囊真皮細胞爬片，免疫熒光檢測LN、FN、Vimentin的表達（實驗步驟按產品說明書進行），Ⅰ抗效價均為1∶100，Ⅱ抗效價1∶100，SABC－Cy3顯色后，DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.4 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按0.15g/1.5mL配制，每天每只大鼠灌胃兩次，間隔12h，灌胃量1.5mL/200g，連續(xù)灌胃，分別在3d、5d、7d腹主動脈血，每個時間點共灌胃5只大鼠，取血當日早晨再灌胃1次，間隔1h，麻醉大鼠，打開腹腔，負壓管抽腹主動脈血。靜置30min，3000r/min離心10min，吸取上層血清，將所得同一時間點的5只大鼠的血清混合，50℃滅活30min，0.2μm 濾膜過濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MTT檢測 七厘散含藥血清對P3代毛囊真皮細胞增殖的影響 將P2代毛囊細胞制成細胞懸液，按3000個/孔種植入96孔板，24h后更換無血清DMEM培養(yǎng)基；24h后棄培養(yǎng)基，將細胞分成空白對照組、無血清組、0%含藥血清組、2.5%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，F(xiàn)BS補足血清總體積百分比為20%，每組7個復孔，分別添加相應的藥物100μL/孔；24h后棄培養(yǎng)基，加入0.5mg/mL MTT 100μL/孔；37℃、5%CO2條 件 下 放 置 4h，加 DMSO100μL/孔，震蕩10min，紫外分光光度計檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中單因素方差分析（one－way ANOVA）進行組間均數(shù)的比較，兩兩組間均數(shù)比較視方差齊性檢驗（以0.1作為檢驗水準進行Levene檢驗）結果，當方差齊同時，用LSD檢驗，當方差不齊時，用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SD乳鼠毛囊細胞分離培養(yǎng)結果 種植后細胞很快貼壁，24h后可見貼壁細胞呈，可見從SD乳鼠毛囊有成纖維狀細胞遷出（圖1），3d細胞長滿培養(yǎng)瓶約80%左右，進行傳代，殘留的毛囊及組織塊隨著傳代和換液逐漸除去，細胞傳至P3代時呈較純化的成纖維狀細胞（圖2）。

2.2 SD乳鼠毛囊真皮細胞免疫熒光檢測結果

分離培養(yǎng)的SD乳鼠毛囊真皮成纖維狀細胞，免疫熒光檢測FN（圖3）、LN（圖4）、Vimentin（圖5）表達陽性。

2.3 MTT檢測七厘散含藥血清對P3代毛囊真皮細胞增殖的影響 七厘散灌胃后，3d、5d、7d含藥血清對P3代毛囊真皮細胞24h增殖的作用趨勢相同，均在含藥血清5%組對細胞促增殖作用達到最大，并且促增殖作用優(yōu)于普通的胎牛血清；之后隨著含藥血清體積百分比增加促增殖作用下降。3d和5d含藥血清組的促增殖作用優(yōu)于7d含藥血清組。

表1 七厘散含藥血清作用24h對SD乳鼠毛囊成纖維細胞增殖的影響

取3d、5d、7d含藥血清組的數(shù)值分別進行單因素ANOVA分析，3d組F＝0.014，采用LSD法，發(fā)現(xiàn)不同體積分數(shù)含藥血清組間有顯著性差異（P＝0.03），3d含藥血清組中5%含藥血清組刺激細胞增殖效果最佳；5d組、7d組方差不齊（分別為F＝0242，F(xiàn)＝0.219），用Tamhane’s T2檢驗方法，空白組與其他組之間有顯著性差異（P＜0.004），其它組間差異均無顯著性意義（P＞0.05），可見3d組5%七厘散含藥血清對細胞促增殖作用最好。

3 討 論FSC是組織工程皮膚理想的種子細胞，但是毛囊干細胞的有效增殖和定向分化至今仍未解決［1－4］。毛囊真皮根鞘中的成纖維細胞能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等ECM 成分和bFGF、VEGF、EGF等多種細胞因子［5，6］，能促進FSC分化為表皮細胞并促進毛囊的完整修復，因此深入研究毛囊真皮鞘成纖維細胞的生物學特性、利用其改善毛囊干細胞的增殖和定向分化能力具有重要意義。

七厘散是著名的傷科常用中成藥，廣泛應用于外科瘡瘍、燙傷、跌打損傷、金刃重傷等病癥，療效顯著。本項目組前期研究證明七厘散作用于小鼠觸須部去表皮創(chuàng)面，具有明顯的抗炎、促修復作用。創(chuàng)面修復早期有大量炎細胞滲出、浸潤；修復中期表皮細胞、成纖維細胞增殖明顯，膠原纖維的合成和分泌增加；修復晚期真皮膠原纖維排列規(guī)則，新生毛細血管較多，創(chuàng)面表皮修復，毛囊重新形成，其療效優(yōu)于臨床西藥EGF，說明中藥通過對創(chuàng)面微環(huán)境的改善，促進膠原纖維的合成和分泌，膠原纖維能有效促進表皮細胞的遷移和分化［7］，能促進表皮及毛囊的重新生成［8］。

本實驗免疫熒光檢測所分離培養(yǎng)的毛囊真皮細胞FN、LN、Vimentin表達陽性，說明所培養(yǎng)的細胞是成纖維細胞。七厘散灌胃后3d、5d、7d的含藥血清按不同體積百分比作用于體外培養(yǎng)的毛囊真皮成纖維細胞24h，7d七厘散含藥血清組較3d組和5d組促增殖作用較差。七厘散含藥血清體積百分數(shù)5%促增殖效果最佳，SPSS統(tǒng)計軟件分析發(fā)現(xiàn)，3d組和5d組優(yōu)于7d組，且3d組和5d組之間差別無統(tǒng)計學意義，說明灌胃3d即為最佳的時間點。每組中均隨著七厘散含藥血清體積百分比增加，促毛囊真皮成纖維細胞增殖的作用增強，當七厘散含藥血清體積百分數(shù)5%促增殖效果最佳，之后隨著含藥血清體積百分比增加，促增殖作用下降，說明七厘散對真皮成纖維細胞生長的調節(jié)是雙向的，在創(chuàng)傷修復中以促增殖為主，當修復到一定程度，促增殖作用下降，防止膠原纖維過度堆積，形成瘢痕組織，充分體現(xiàn)了中藥促進皮膚愈合的整體性和雙向性調節(jié)［9，10］。

［1］Pontiggia L，Biedermann T，Meuli M，et al.Markers to evaluate the quality and self－renewing potential of engineered human skin substitutes in vitro and after transplantation［J］.J Invest Dermatol，2009，129（2）：480－490.

［2］Plikus MV，Mayer JA，de la Cruz D，et al.Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration［J］.Nature，2008，451（7176）：340－344.

［3］Qi SH，Liu P，Xie JL，et al.Experimental study on repairing of nude mice skin defects with composite skin consisting of xenogeneic dermis and epidermal stem cells and hair follicle dermal papilla cells［J］.Burns，2008，34（3）：385－392.

［4］朱堂友，郝 飛，伍津津，等.人毛囊細胞來源雙層皮膚替代物的構建和組織學特征［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2007，29（12）：1187－1189.

［5］Charruyer A，Ghadially R.Stem cells and tissue－engineered skin［J］.Skin Pharmacol Physiol，2009，22（2）：55－62.

［6］Metcalfe AD，F(xiàn)erguson MW.Bioengineering skin using mechanisms of regeneration and repair［J］.Biomaterials，2007，28（34）：5100－5113.

［7］劉愛軍，易 華，杜標炎.龍血竭對小鼠觸須部毛囊干細胞增殖和分化的影響［J］.陜西中醫(yī)，2011，32（8）：1089－1092.

［8］劉愛軍，易 華，杜標炎.七厘散促小鼠觸須部創(chuàng)面修復及部分機制探討［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（4）：490－492.

［9］吳江群，聶興舉，秦澤蓮.氧化苦參堿對病理性瘢痕成纖維細胞增殖凋亡的影響［J］.中國微創(chuàng)外科雜志，2011，11（3）：259－263.

［10］李鳳玉，賈國洪，萬 立，等.脂多糖對增生性瘢痕患者正常皮膚成纖維細胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA和膠原酶 mRNA表達的影響［J］.臨床醫(yī)學工程，2011，18（2）：161－164.