謝 培 周永學(xué)▲ 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽(yáng)712046）

△陜西省胃腸病證方藥重點(diǎn)研究室（咸陽(yáng)712046）

功能性便秘是常見的胃腸疾病，發(fā)病率高，危害面廣，但迄今為止，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)FC的病因和發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚［1］，研究其發(fā)病機(jī)制及診治方法對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義，而功能性便秘動(dòng)物模型的建立是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，因此探討功能性便秘模型的建立更具有研究意義。目前功能性便秘模型的建立多以小鼠為目標(biāo)動(dòng)物［2－4］，但因小鼠耐受力較弱，不適宜長(zhǎng)期造模給藥，且主要用于觀察排便實(shí)驗(yàn)，制約了有關(guān)機(jī)制探討的研究。因此本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，選取國(guó)內(nèi)外報(bào)道中最具優(yōu)勢(shì)的復(fù)方地芬諾酯造模，探討如何建立持續(xù)而穩(wěn)定的功能性便秘大鼠動(dòng)物模型。

1 材 料1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠，90只，體重200－250g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（陜）2012－003，經(jīng)檢驗(yàn)合格及適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后備用。

1.2 藥品及試劑 復(fù)方地芬諾酯片，江蘇常州康普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1304042；大鼠胃動(dòng)素Elisa檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：23007331；大鼠胃泌素Elisa檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：23007914上海西唐生物技術(shù)有限公司；水合氯醛：上海山浦化工有限公司，生產(chǎn)日期：2012年11月10日。

1.3 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀：ELX808，美國(guó)Bio－Tek公司；離心機(jī)：KDC－40低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

2 方 法2.1 分組 取SD大鼠90只，體重220－250g，隨機(jī)分為6組，每組15只，設(shè)空白組、復(fù)方地芬諾酯8mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg劑量組。

2.2 復(fù)方地芬諾酯混懸液的制備 將復(fù)方地芬諾酯片（每片含鹽酸地芬諾酯2.5mg，硫酸阿托品0.025mg）以研缽研磨至極細(xì)粉末，用蒸餾水按各劑量組所需濃度配置成復(fù)方地芬諾酯混懸液備用。

2.3 建立模型 造模方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］進(jìn)行改進(jìn)：動(dòng)物禁食不禁水12小時(shí)后，分別以10mL/kg體積（8mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL濃度）按組別灌胃復(fù)方地芬諾酯混懸液，每天一次，給藥6周。

2.4 指標(biāo)的檢測(cè) 2.4.1 一般行為學(xué)觀察：每?jī)芍艽笫蠓Q重一次；每日觀察動(dòng)物臨床表現(xiàn)及排便情況，詳細(xì)記錄，統(tǒng)計(jì)各組大鼠的死亡數(shù)，分析死亡原因。

2.4.2 血清生化指標(biāo)的檢測(cè)：末次給藥后2h，腹腔注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉，下腔靜脈采血，室溫放置30min后，將KDC－40低速離心機(jī)調(diào)至3000轉(zhuǎn)/分，10min后分離待測(cè)血清，根據(jù)大鼠胃動(dòng)素、大鼠胃泌素Elisa試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清胃動(dòng)素、胃泌素含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)采用 SPSS17.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（±s）表示，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果3.1 一般行為表現(xiàn) 造模后各組大鼠相繼出現(xiàn)精神狀態(tài)差，喜扎堆，活動(dòng)減少，進(jìn)食減少，大便粒型小、干硬，尤以30mg組出現(xiàn)最早，癥狀最為明顯；給藥第6天，20mg和30mg組個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)尿道口白色米粒樣分泌物，小便點(diǎn)滴而出，尿道外口周圍皮毛濡濕，初步推斷為尿道不暢，30mg組個(gè)別動(dòng)物甚至出現(xiàn)血尿；第9天，15mg組個(gè)別大鼠出現(xiàn)尿道口白色米粒樣分泌物；第11天20mg組大鼠逐漸出現(xiàn)血尿，進(jìn)食少，精神狀態(tài)差；第13天，30mg組有大鼠死亡，解剖見，其胃及腸道內(nèi)無(wú)實(shí)質(zhì)性內(nèi)容物僅有少量水液，腸壁薄而透明，左腎萎縮，腎實(shí)質(zhì)及髓質(zhì)部分已代償性壞死，右腎色澤暗黑。第15天，30mg組4只大鼠出現(xiàn)小便呈米泔水樣，且淋漓而下；隨著造模的繼續(xù)，20mg和30mg組大鼠死亡逐漸增多，解剖可見其膀胱極度脹大，內(nèi)有大量?jī)?chǔ)留小便其胃內(nèi)僅有少量水液，腸道呈結(jié)節(jié)狀，內(nèi)有大量顆粒狀糞便，腸壁薄而透明，其雙腎色澤暗紅而稍有腫大。至造模結(jié)束，除8mg/kg劑量組外，其余各組與空白組對(duì)比均有精神狀態(tài)差，活動(dòng)減少，扎堆，體重減輕，進(jìn)食減少，被毛脫落，大便干硬，粒型小，符合便秘表現(xiàn)［6］。

3.2 不同劑量復(fù)方地芬諾酯對(duì)大鼠體重和死亡率的影響與空白組比較，兩周后各造模組大鼠體重均有差異；造模四周后和六周后，8mg/kg劑量組未見明顯差異（P＞0.05），與其余各組對(duì)比均有顯著性差異（P＜0.01），隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，除8mg和15mg組外，其余各造模組均有大鼠死亡，且與劑量的大小成正比關(guān)系，其死亡率經(jīng)卡方檢驗(yàn)顯示，有顯著差異。結(jié)果見表1。

表1 不同劑量復(fù)方地芬諾酯對(duì)大鼠體重及死亡率的影響（g，±s，n＝15）

表1 不同劑量復(fù)方地芬諾酯對(duì)大鼠體重及死亡率的影響（g，±s，n＝15）

注：各給藥組與空白組比較 △P＜0.05 ▲P＜0.01。

組造模前 造模后二周 造模后四周 造模后六周 死亡率空白組 221.23±6.08 265.66±9.67 389.16±14.54 419.57±24.66 0/別15 15 8mg組 222.29±5.63 251.28±14.60△ 386.14±11.30 415.07±20.85 0/15 15mg組 222.80±7.47 246.37±5.87▲ 334.96±26.01▲ 324.57±52.51▲ 0/15 20mg組 222.61±5.54 227.10±4.87▲ 345.68±31.82▲△ 343.89±51.31▲ 2/15 25mg組 222.32±5.68 221.53±7.70▲ 302.66±16.81▲ 302.09±44.35▲ 4/15 30mg組 221.73±6.85 203.49±5.83▲△ 283.73±18.48▲△ 301.53±16.60▲ 7/

表2 不同劑量復(fù)方地芬諾酯對(duì)大鼠血清中胃動(dòng)素和胃泌素含量的影響（g，±s，n＝15）

表2 不同劑量復(fù)方地芬諾酯對(duì)大鼠血清中胃動(dòng)素和胃泌素含量的影響（g，±s，n＝15）

注：各給藥組與對(duì)照組比較 △P＜0.05 ▲P＜0.01。

組109.09±5.83 13.83±1.16 8mg組 109.85±2.19 13.69±0.95 15mg組 98.16±5.20▲ 10.96±0.33▲20mg組 89.84±4.77▲ 11.80±1.06▲25mg組 77.76±3.13▲ 9.27±1.05▲30mg組 74.07±3.48▲ 9.48±1.44胃動(dòng)素 胃泌素空白組別▲

3.3 不同劑量復(fù)方地芬諾酯對(duì)大鼠血清胃動(dòng)素和胃泌素含量的影響 與空白組比較，8mg組大鼠血清胃動(dòng)素和胃泌素含量未見明顯差異（P＞0.05），其余各造模組大鼠血清中胃動(dòng)素、胃泌素含量均顯著減少（P＜0.01），且與劑量大小成一定相關(guān)性。

4 討 論復(fù)方地芬諾酯［7］由鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品組成。鹽酸地芬諾酯為人工合成的具有止瀉作用的阿片生物堿，現(xiàn)已代替阿片制劑成為廣泛而有效的非特異性止瀉藥，它直接作用腸平滑肌，能提高腸張力、抑制腸蠕動(dòng)，使腸內(nèi)水分吸收增加，致使排便減少或排便困難，從而引起便秘。利用地芬諾酯灌胃是目前應(yīng)用最為廣泛的的動(dòng)物便秘模型復(fù)制方法，但多用于復(fù)制小鼠便秘模型［8－14］，尚無(wú)應(yīng)用地芬諾酯灌胃復(fù)制大鼠便秘模型的報(bào)道。在便秘的實(shí)驗(yàn)研究中，小鼠多用來(lái)進(jìn)行腸道的蠕動(dòng)實(shí)驗(yàn)，但小鼠體積小，標(biāo)本量小，從而限制了胃腸道神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸道激素以及腸道電生理指標(biāo)的觀察。大鼠易飼養(yǎng)，成本可控，體型大小合適，給藥容易，采樣量合適方便，幾乎已被用于各種藥物的篩選及藥效評(píng)價(jià)，尤其在某些藥物的篩選中大鼠還具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，所以本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，采用不同劑量的地芬諾酯灌胃，對(duì)便秘模型進(jìn)行探索研究。

研究發(fā)現(xiàn)，15mg以上各組大鼠造模后相繼出現(xiàn)大便粒型小、便質(zhì)干硬，便量少的顯著便秘的表現(xiàn)，同時(shí)伴有精神狀態(tài)差，喜扎堆，活動(dòng)減少，進(jìn)食減少等表現(xiàn)；通過(guò)對(duì)體重以及死亡率的分析，15mg組大鼠不但有大鼠便秘的臨床表現(xiàn)，而且體重出現(xiàn)明顯減輕且動(dòng)物無(wú)死亡；胃腸道激素檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，15mg組大鼠胃腸道激素含量明顯降低。因此可知，復(fù)方地芬諾酯15mg/kg/天灌胃，約2周后即可成功復(fù)制大鼠功能性便秘模型。

本次造模發(fā)現(xiàn)15mg組灌胃兩周便可出現(xiàn)明顯便秘表現(xiàn)，而20mg、25mg、30mg組癥狀出現(xiàn)更早，但后期會(huì)出現(xiàn)動(dòng)物死亡。造模過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，15mg組以上大鼠出現(xiàn)脫毛（嚴(yán)重者可見大片紅色皮膚，以腹部最明顯）、小便不暢、尿血、畏寒、蜷縮、消瘦等與中醫(yī)腎虛證候類似癥狀，其是否符合中醫(yī)腎虛便秘證候模型，還有待于進(jìn)一步的研究探索。

［1］Kyle G.Constipation：symptoms，assessment and treatment［J］.British Journal of Nursing，2011，20（22）：1432－1432.

［2］王 嵐，彭 成.便秘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24（2）：174－176.

［3］萬(wàn)錦洲，馬錦星，劉 卉.一種簡(jiǎn)易的小鼠便秘模型［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1994 10（l）：71－72.

［4］劉井如，季宇彬，陳明蒼.便秘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，11（18）：22，353－356.

［5］李業(yè)鵬，崔生輝，江 濤.小鼠便秘模型的建立［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2000，12（1）：1－4.

［6］錢柏初，史 紅，鄭曉亮.正常和便秘模型動(dòng)物排便實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（12）：1339－1343.

［7］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2005年版.二部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：425.

［8］鄭 倩，徐 華.便秘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.臨床消化病雜志，2012，189（3）：189－191.

［9］賈紅慧，袁 潔，李強(qiáng)華.實(shí)驗(yàn)條件對(duì)復(fù)方地芬諾酯小鼠便秘模型的影響［J］.中藥藥理與臨床2008；24（4）：70－72.

［10］周永學(xué)，時(shí)丹丹，王 斌，等.通便玉蓉丸對(duì)便秘小鼠大腸含水量及5－HT含量的影響研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，11（33）：6，57－58.

［11］曹俊嶺，陳剛正，任漢陽(yáng).火麻仁油對(duì)復(fù)方地芬諾酯致便秘模型小鼠血清及腦NO及胸腺組織學(xué)的影響［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，2（1）：25－26.

［12］彭 圓，程 靜，李 偉，等.便秘模型小鼠皮膚老化的觀察［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2012；6（21）：6，947－949.

［13］涂 莉，高鐵祥，黃 麗.松鶴怡年方通便作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2009，1（16）：1，16－17.

［14］劉 彬，徐貴發(fā)，韓文婷.羅漢參對(duì)小鼠通便作用的研究，山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）2009；2（47）：2，95－98.