劉立穎 張 又 賈立平 董慧瑾 錢(qián) 淵

腹瀉是嬰幼兒除呼吸道感染外最常見(jiàn)的疾病，而腺病毒(Adenovirus，Ad)則是除輪狀病毒和諾如病毒外兒童腹瀉最重要的病原［1］。由于Ad感染目前尚無(wú)特效的治療藥物和疫苗，因此對(duì)其進(jìn)行有效地防控，全面了解其在腹瀉兒童中的感染狀況顯得尤為重要。國(guó)內(nèi)外有關(guān)Ad檢出率的差別較大，巴西［2］、法國(guó)［3］和澳大利亞［4］的腹瀉患兒中 Ad的檢出率分別為3.6%，5%和6%，而在一項(xiàng)對(duì)亞洲3國(guó)(越南、日本、韓國(guó))腹瀉患兒Ad的研究中［5］，越南兒童Ad的檢出率僅為2.8%，韓國(guó)兒童則達(dá)到了8.7%，日本兒童為5%。我國(guó)也有多個(gè)地區(qū)報(bào)道了腹瀉患兒Ad的感染情況，檢出率為3.7%～17.6%［6，7］，造成這種差異的原因可能是多方面的。有文獻(xiàn)推測(cè)［8］與地理位置、檢測(cè)時(shí)間、氣候條件、不同人群遺傳和免疫背景的差別有關(guān)，也可能與Ad檢測(cè)的方法、檢測(cè)Ad型別的完整性、樣本的來(lái)源(門(mén)診或住院)有關(guān)。本研究擬對(duì)首都兒科研究所(我院)門(mén)診和住院腹瀉患兒的糞便標(biāo)本，以PCR的方法檢測(cè)腸道Ad(EAd)和非腸道Ad(NEAd)，進(jìn)一步豐富腹瀉患兒Ad檢出率臨床信息。

1 方法

1.1 急性腹瀉的診斷標(biāo)準(zhǔn)24h大便次數(shù)增加至≥3次或大便次數(shù)超過(guò)正常排便次數(shù)且大便性狀明顯改變，包括稀水樣、黏液樣或稀糊樣便等，無(wú)膿血。

1.2 病例來(lái)源 ①2011年1月至2012年12月在我院門(mén)診診斷為急性腹瀉的患兒;②2010年1月至2013年12月在我院因急性腹瀉住院或住院期間出現(xiàn)腹瀉癥狀并診斷為急性腹瀉的患兒;③年齡0～6歲。

1.3 糞便標(biāo)本 門(mén)診急性腹瀉患兒糞便標(biāo)本采集時(shí)間為就診當(dāng)天;因急性腹瀉住院患兒的糞便標(biāo)本采集時(shí)間為住院當(dāng)天;住院期間出現(xiàn)腹瀉癥狀的患兒于出現(xiàn)腹瀉癥狀當(dāng)天采集糞便標(biāo)本。本研究用于檢測(cè)Ad的糞便標(biāo)本為臨床糞便常規(guī)和輪狀病毒檢測(cè)后剩余的糞便標(biāo)本，在排除了糞便常規(guī)檢測(cè)顯微鏡高倍視野下WBC＞5個(gè)和有RBC者后，于-20℃保存?zhèn)溆?。每例送檢糞便標(biāo)本記錄性別、年齡和送檢日期，住院患兒記錄住院號(hào)和病區(qū)。

1.4 Ad分型 人類(lèi)Ad已發(fā)現(xiàn)56個(gè)血清型并根據(jù)血凝特性分歸為A至G組［9］。A組包括Ad12、18和31;B組包括Ad3、7、11、14、16、21、34、35、50 和 5 5;C 組包括 Ad1、2、5 和6;D 組 包括 Ad8～10、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、42～49、51、53、54 和 5 6;E 組包括 Ad4;F 組包括 Ad40和41;G組包括Ad52。其中F組Ad是引起腹瀉最主要的類(lèi)型，又被稱為 E Ad［10］;余則為 N EAd，也可以引起腹瀉癥狀。

1.5 Ad檢測(cè)

1.5.1 DNA提取 參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的改良糞便DNA 提 取法［11］，使用 D NAzol試劑(MRC 公司，美國(guó))提取糞便標(biāo)本DNA。

1.5.2 Ad檢測(cè) 使用針對(duì)Ad所有型別的通用引物［12，13］檢測(cè)糞便標(biāo)本，對(duì)通用引物檢測(cè)陽(yáng)性的糞便標(biāo)本用特異性引物［14］進(jìn)一步進(jìn)行EAd鑒定，引物見(jiàn)表1，反應(yīng)條件見(jiàn)文獻(xiàn)［11］。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(含0.5%μg·mL-1溴化乙錠)電泳，60 V，25 min。為降低吞入呼吸道分泌物Ad檢出的概率，對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)核(加入模板量的1/2)，2次結(jié)果均為中等強(qiáng)度以上條帶的標(biāo)本判定為陽(yáng)性，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司對(duì)所有PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)上進(jìn)行分型驗(yàn)證。

1.5.3 輪狀病毒檢測(cè) 采用輪狀病毒抗原檢測(cè)試劑盒(Microgen Bioproducts Ltd，UK)對(duì)Ad檢測(cè)陽(yáng)性的糞便標(biāo)本進(jìn)行輪狀病毒抗原檢測(cè)。

表1 Ad鑒定引物Tab 1 Primers for Ad identification

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，率的顯著性采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)Ad感染的流行特征采用按年齡分析的方法［8，15］，分為新生兒、～6月齡、～1歲、～2歲和～6歲。(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 進(jìn)入本文分析腹瀉患兒3 357例。其中門(mén)診腹瀉患兒862例，男556例(64.5%)，女306例，新生兒2例(0.2%)，～6月齡253例(29.4%)，～1歲310例(36.0%)，～2歲224例(26.0%)，～6歲73例(8.5%)。住院腹瀉患兒2 495例，男1 547例(62.0%)，女948例，其中因急性腹瀉住院的患兒367例(14.7%)，住院期間出現(xiàn)腹瀉的患兒2 128例;新生兒252例(10.1%)，～6月齡

826例(33.1%)，～1歲 4 48例(18.0%)，～2歲 6 41例(25.7%)，～6歲328例(13.1%)。

2.2 Ad檢出情況及型別分布3 357例腹瀉患兒糞便標(biāo)本中Ad檢測(cè)陽(yáng)性341例(10.2%)。門(mén)診腹瀉患兒Ad陽(yáng)性70/862例(8.1%)，分屬A、C和F組。圖1A顯示，EAd 40例(57.1%)，包括 Ad41和 40型別;NEAd 30例(42.9%)，包括Ad31和2等5種型別。住院腹瀉患兒Ad陽(yáng)性271/2 128例(10.9%)，分屬A、B、C、E和F組。圖1B顯示，EAd 114例(42.1%)，包括 Ad41和40型別;NEAd 157例(58.9%)，包括Ad31和7等11種型別。門(mén)診和住院腹瀉患兒中，Ad和NEAd檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為 3 53.9 和 9 .63，P 分別為 0 .022 和 0 .002)，而EAd檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.007，P=0.931)。

2.3 Ad陽(yáng)性病例的性別分布 門(mén)診腹瀉男女患兒Ad的檢出率分別為9.0%(50/556)和6.5%(20/306)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.597，P=0.206)。住院腹瀉男女患兒Ad檢出率分別為11.7%(181/1 547)和9.5%(90/948)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.956，P=0.086)。住院和門(mén)診男女患兒Ad檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為3.066和2.539，P分別為0.080和0.112)。

2.4 Ad陽(yáng)性病例的年齡分布 門(mén)診腹瀉患兒Ad檢出率:～6月齡為4.3%(11/253)，其中EAd 5例，NEAd 6例;～1歲為7.7%(24/310)，其中EAd 10例，NEAd 14例;～2歲為11.6%(26/224)，其中 E Ad 18例，NEAd 8例;～6歲為12.3%(9/73)，其中EAd 7例，NEAd 2例?！?歲和～6歲以EAd感染為主。各年齡段Ad檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.246，P=0.017)。

住院腹瀉患兒Ad檢出率，新生兒為4.4%(11/252)，其中EAd 9例，NEAd 2例;～6月齡為9.4%(78/826)，其中EAd 31例，NEAd 47例;～1歲為13.2%(59/448)，其中EAd 17例，NEAd 42例;～2歲為12.3%(79/641)，其中EAd 41例，NEAd 38例;～6歲為13.4%(44/328)，其中

EAd 16例，NEAd 28例。除新生兒和～2歲外，其他各年齡段均以NEAd感染為主。各年齡段Ad檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.791，P=0.001)，兩兩比較，～6月齡與～1歲患兒Ad檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.203，P=0.04)，其他各年齡段兩兩比較Ad檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 Ad全年感染的時(shí)間分布 表2顯示，無(wú)論是門(mén)診亦或住院腹瀉患兒，全年各月均可見(jiàn)Ad檢出。門(mén)診腹瀉患兒 Ad檢出率在1、4、6、8 和12 月較低(3.7%～4.6%)，在3、5和10月較高(12.0%～12.7%)。住院腹瀉患兒Ad檢出率4月最低(5.8%)，5月(16.2%)和6月(16.5%)最高。

2.6 合并輪狀病毒感染情況 門(mén)診和住院腹瀉患兒Ad合并輪狀病毒感染10.8%(37/341)，其中門(mén)診腹瀉患兒Ad合并輪狀病毒感染11.4%(8/70)，住院腹瀉患兒Ad合并輪狀病毒感染10.7%(29/271)，與門(mén)診腹瀉患兒差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.030，P=0.862)。合并輪狀病毒感染男女性分別為12.1%(28/231)和8.2%(9/110)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.195，P=0.274)。僅住院腹瀉患兒新生兒Ad陽(yáng)性病例未合并有輪狀病毒感染，其他年齡段均合并有輪狀病毒感染。

表2 門(mén)診和住院腹瀉患兒全年Ad感染分布［n/N(%)］Tab 2 Monthlydistribution for Addetection rate in outpatient andhospitalizeddiarrheal children［n/N(%)］

3 討論

本研究進(jìn)入分析的病例不僅僅是單純腹瀉的患兒，還包括因其他疾病入院但也出現(xiàn)了腹瀉癥狀的住院患兒，糞便標(biāo)本中檢測(cè)到的Ad尤其是NEAd有可能來(lái)自其他非腸道系統(tǒng)感染。

本研究Ad的總檢出率為10.2%，高于國(guó)內(nèi)外大多數(shù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道［2，4～6，8，16～21］，低于本研究團(tuán)隊(duì)前期北京地區(qū)住院腹瀉患兒 Ad檢出率(14.6%)，也低于日本(12.5%)［22］、英國(guó)(15.0%)［23］、德國(guó)(14.0%)［24］和中國(guó)天津(17.62%)［7］腹瀉患兒Ad檢出率。造成Ad檢出率差異的因素非常復(fù)雜，有研究推測(cè)，標(biāo)本來(lái)源于單純腹瀉就診的門(mén)診患兒、單純腹瀉住院的患兒、社區(qū)的腹瀉患兒和住院期間出現(xiàn)腹瀉癥狀的患兒所得出的Ad檢出率可能存在差異，本研究單純腹瀉就診的門(mén)診患兒Ad檢出率(8.1%)和住院腹瀉患兒Ad檢出率(10.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本文住院腹瀉病例有以急性腹瀉入院的病例，也有入院期間出現(xiàn)腹瀉癥狀的病例，這部分病例未能區(qū)分社區(qū)還是醫(yī)院獲得性腹瀉;本研究團(tuán)隊(duì)前期以有腹瀉癥狀住院患兒Ad檢出率的研究表明，社區(qū)獲得性Ad檢出率(14.9%)和院內(nèi)獲得性Ad檢出率(14.3%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明導(dǎo)致Ad檢出率差異還是與標(biāo)本來(lái)源單純性有關(guān)。目前常見(jiàn)的檢測(cè)Ad的方法包括電鏡觀察法、EIA方法(包括ELISA法，膠體金抗原檢測(cè)等)和PCR方法。電鏡觀察方法雖然直觀準(zhǔn)確，但由于設(shè)備技術(shù)所限，應(yīng)用有限;EIA方法操作方便，有文獻(xiàn)報(bào)道PCR方法比 EIA方法Ad檢出率高10%［21］，采用EIA方法檢測(cè)Ad會(huì)影響整體Ad的檢出率。盡管近些年來(lái)更多的研究采用PCR方法檢測(cè)Ad，但檢出率與是否為通用引物擴(kuò)增Ad全部型別有關(guān)，本研究NEAd的檢出率在住院腹瀉患兒為6.3%(157/2 495)、門(mén)診腹瀉患兒為3.5%(30/862)，如果檢測(cè)NEAd型別不完整也會(huì)降低Ad的檢出率。多個(gè)數(shù)據(jù)顯示低緯度熱帶亞熱帶地區(qū)Ad檢出率相對(duì)偏低，如越南(2.8%)［5］，中國(guó)深圳(1.8%)［19］、成都(2.0%)［18］、南京(2.9%)［20］，相比較而言高緯度地區(qū)如日本(8%)［17］、法國(guó)(12%)［3］、德國(guó)(14.0%)［24］、中國(guó)天津(17.6%)［7］、北京地區(qū)(10.2%～14.6%)Ad檢出率更高。

多項(xiàng)腹瀉患兒病毒感染狀況的研究表明:腹瀉患兒中各種病毒(主要包括輪狀病毒、腺病毒、杯狀病毒、星狀病毒)共感染率并不高，如1項(xiàng)法國(guó)研究［3］，4種病毒混合感染率為9.5%，而來(lái)自希臘［21］的報(bào)道為4.4%，中國(guó)長(zhǎng)春為7.2%［25］;也有研究表明，Ad陽(yáng)性患者杯狀病毒的共感染率為8%，星狀病毒的共感染率僅為2%［23］;來(lái)自中國(guó)深圳的研究顯示杯狀病毒共感染率為15%，未見(jiàn)星狀病毒共感染［19］。本文Ad陽(yáng)性腹瀉患兒合并輪狀病毒的感染率為10.8%，有接近90%的患兒在本研究中被測(cè)定為Ad感染，雖然本研究未檢測(cè)其他腸道病毒如杯狀病毒和星狀病毒，但仍說(shuō)明Ad同兒童腹瀉密切相關(guān)，是兒童腹瀉重要致病原。

本文住院腹瀉患兒Ad檢出率(10.9%)高于門(mén)診腹瀉患兒(8.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與因疾病住院導(dǎo)致Ad感染機(jī)會(huì)增加有關(guān)。這一結(jié)果與本研究團(tuán)隊(duì)前期研究醫(yī)院獲得性Ad腹瀉(14.3%)略低于社區(qū)獲得性 Ad腹瀉(14.9%)結(jié)果不同，后者界定了住院后48h后才出現(xiàn)腹瀉癥狀為醫(yī)院獲得性腹瀉，而本文住院患兒中不僅包括了367例(14.7%)以急性腹瀉入院的患兒，也沒(méi)有對(duì)住院期間發(fā)生腹瀉進(jìn)行時(shí)間上的定義。本文門(mén)診Ad陽(yáng)性病例以EAd(57.1%)為主，住院Ad陽(yáng)性病例以NEAd(57.9%)為主，兒童醫(yī)院中感染仍然是主要的住院原因，可能增加了NEAd感染機(jī)會(huì)。

EAd中，Ad41是本研究中檢出最多的Ad型別，分別占門(mén)診和住院Ad陽(yáng)性病例的45.7%和39.5%，是門(mén)診和住院Ad陽(yáng)性病例主要型別，Ad40是門(mén)診Ad陽(yáng)性病例次要型別(11.4%)，但Ad40在住院Ad陽(yáng)性病例僅為2.6%。NEAd分別占門(mén)診和住院Ad陽(yáng)性病例的42.9%和57.9%，與一項(xiàng)來(lái)自南京［20］的報(bào)道具有相似的結(jié)果，但遠(yuǎn)高于其他研究中的比例［5，8，24］。巴西的研究［2］顯示 NEAd 涵括了A～E組，本研究未檢測(cè)到D組Ad。NEAd中，住院腹瀉患兒主要檢出Ad31和7，而門(mén)診腹瀉患兒中常見(jiàn)的是Ad31和2，具有較為明顯的型別優(yōu)勢(shì)。一項(xiàng)包括了越南、韓國(guó)和日本腹瀉患兒研究，檢出的NEAd包括:Ad3、5、8和31，來(lái)自于澳大利亞［4］和中國(guó)蘭州［8］、長(zhǎng)春［25］、深圳［20］的 Ad 檢測(cè)人群，檢出的 NEAd 包括 Ad1、2、6、7、12 和 57 ，NEAd 的檢出率沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的型別優(yōu)勢(shì)。本研究NEAd檢出數(shù)量多、型別豐富，而且型別優(yōu)勢(shì)明顯，一方面與使用高度敏感的PCR方法有關(guān)，所設(shè)計(jì)的通用引物可以擴(kuò)增Ad所有型別有關(guān)，另一方面與檢測(cè)的樣本量大、樣本來(lái)源的多樣性有關(guān)(以單純腹瀉就診的門(mén)診患兒、以單純腹瀉住院的患兒，住院期間發(fā)生腹瀉的患兒)。值得注意的是，無(wú)論是在門(mén)診亦或住院患兒Ad31是僅次于Ad41的優(yōu)勢(shì)型別的NEAd，本研究同一實(shí)驗(yàn)室的呼吸道Ad長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)未檢測(cè)到Ad31［26］，提示Ad31可能主要作用于胃腸道，并導(dǎo)致兒童腹瀉。

本研究住院腹瀉新生兒Ad檢出率遠(yuǎn)低于其他年齡組，與輪狀病毒檢出率沒(méi)有年齡差異［27，28］不同。6個(gè)月后各年齡組Ad的檢出基本沒(méi)有差異，推測(cè)母?jìng)骺贵w在嬰幼兒(6個(gè)月內(nèi))避免Ad性腹瀉，尤其是對(duì)NEAd引起的腹瀉中起到重要的作用。無(wú)論在門(mén)診腹瀉患兒或住院腹瀉患兒中，Ad的檢出在全年各月均可見(jiàn)到，沒(méi)有數(shù)據(jù)支持其感染存在季節(jié)流行差異。來(lái)自中國(guó)蘭州［8］、巴西［2］和澳大利亞［4］的研究也表明腹瀉兒童Ad感染并沒(méi)有一致的流行規(guī)律。

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