劉 戈,馮 昆,趙 靜
(澳門(mén)大學(xué)中華醫(yī)藥研究院,澳門(mén)大學(xué)中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó) 澳門(mén) 999078)
靈芝是一種擁有數(shù)千年藥用歷史的中國(guó)傳統(tǒng)珍稀藥用真菌,具有很高的藥用價(jià)值,屬于擔(dān)子菌綱 (Basidiomycetes)、多孔菌目 (Polyporales)、靈芝科 (Ganodermataceae)、靈芝屬 (Ganoderma),靈芝屬包括大約80種,我國(guó)有44種。熱帶靈芝Ganoderma tropicum(Jungh.)Bres.,在分類學(xué)上屬于靈芝科、靈芝屬真菌。近年來(lái),隨著對(duì)靈芝屬研究的逐漸深入,對(duì)熱帶靈芝的研究也逐漸增多。熱帶靈芝主要分布在中國(guó)、印度尼西亞、馬來(lái)西亞和新加坡4個(gè)國(guó)家[1-4],在中國(guó)主要分布在云南[5]、海南[6]和臺(tái)灣[7]等地。熱帶靈芝在民間多自采自用,具有滋補(bǔ)、強(qiáng)壯、抗腫瘤的功能,福建民間也有報(bào)道稱用它可以治療冠心病[2,3]。本文將從熱帶靈芝的培養(yǎng)方式、化學(xué)成分及分析方法、藥理功能等方面對(duì)熱帶靈芝的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。
目前研究的熱帶靈芝菌種一般經(jīng)過(guò)野外采集后組織分離得到。熱帶靈芝的鑒定一般采取形態(tài)學(xué)鑒定和PCR表征鑒定。張東柱[8]等曾對(duì)熱帶靈芝子實(shí)體和菌絲體形態(tài)進(jìn)行了觀察研究,發(fā)現(xiàn)其成熟孢子不同于赤芝 (Ganoderma lucidum)的卵形孢子,而呈紡錘形 (圖1,劉戈制作),子實(shí)體偶呈扇面形。Utomo等[9]通過(guò)使用特異性引物和 PCR-PFLP,對(duì)rDNA進(jìn)行鑒定,從而分辨出熱帶靈芝。
熱帶靈芝的培養(yǎng)研究主要集中在固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2個(gè)方面。
在培養(yǎng)基的選擇方面,鄧軍等[10]報(bào)道,熱帶靈芝在木屑、蔗渣、廢棉等主料的培養(yǎng)基上都能正常生長(zhǎng),見(jiàn)表1。
表1 不同固體栽培培養(yǎng)基比較
從表1可以看出,蔗渣74%、麥麩25%、過(guò)磷酸鈣1%、桑枝屑73%、麥麩25%、白糖1%、過(guò)磷酸鈣1%的栽培配方產(chǎn)量較高,分別達(dá)到 219.76 g·kg-1和 191.26 g·kg-1,完全使用廢棉種栽培熱帶靈芝產(chǎn)量較低,但是其中加入適量麥麩可以提高產(chǎn)量。劉國(guó)民等[11]通過(guò)米飯培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基 (CA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)組織分離熱帶靈芝,均得到純化的菌絲體;米飯培養(yǎng)基上的菌絲體生長(zhǎng)速度最快,其次為PDA培養(yǎng)基,CA培養(yǎng)基上菌絲體生長(zhǎng)最慢;在繼代培養(yǎng)中,PDA培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)仍優(yōu)于CA培養(yǎng)基,原因在于CA培養(yǎng)基適合細(xì)菌的生長(zhǎng),不適合熱帶靈芝 (大型真菌)菌絲體的生長(zhǎng)。
在培養(yǎng)條件的選擇方面,劉國(guó)民等[11]采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行因變量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種方法、接種菌種量和菌種質(zhì)量均對(duì)其培養(yǎng)有很大影響。在固體平板培養(yǎng)中,菌絲生長(zhǎng)最適pH為5.9,菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為28.8℃。季節(jié)因素考察方面,反季節(jié)栽培容易產(chǎn)生畸形芝,而氣溫回升之后子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育便正常,能長(zhǎng)成掌狀菌蓋。由此可見(jiàn),熱帶靈芝的菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育、出芝過(guò)程以及出芝后子實(shí)體的生長(zhǎng)均需要一個(gè)較高的溫度。子實(shí)體的形成和生長(zhǎng)需要100 lx~200 lx的光照,無(wú)光照則不能形成菌蓋,但菌絲生長(zhǎng)階段不需要光照,如果光照超過(guò)100 lx對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有極顯著的抑制作用[10]。
在熱帶靈芝的培養(yǎng)過(guò)程中,碳元素含量減少而氮元素含量升高。培養(yǎng)前期,木質(zhì)素的分解速度快于半纖維素和纖維素,后期則相反,最終碳元素以二氧化碳的形式散失,這一現(xiàn)象與胞外酶的產(chǎn)生和積累息息相關(guān)。纖維素酶的高峰出現(xiàn)在子實(shí)體形成過(guò)程中期,且淀粉酶的活性在培養(yǎng)前期較高,20 d時(shí)達(dá)高峰。纖維素酶的活性變化規(guī)律與纖維素的降解規(guī)律趨于一致,多酚氧化酶變化規(guī)律不明顯,所以尚不能肯定多酚氧化酶活性與木質(zhì)素降解的關(guān)系。在可溶性糖的方面,木糠麥麩培養(yǎng)基中可溶性糖的含量,在接種后10 d內(nèi)由2.26%降為1.69%。而子實(shí)體形成過(guò)程中,基質(zhì)中的可溶性糖含量逐漸增加,最終達(dá)到2.84%。其原因可能前期菌絲體積累過(guò)程需要消耗大量的碳源,而后期出芝過(guò)程中菌絲體分泌出分解酶類,使淀粉、木質(zhì)纖維素分解成為可溶性糖類,還有可能是菌絲體自身分泌出可溶性糖和菌絲體本身的溶解。另外,相同條件下熱帶靈芝子實(shí)體中鍺元素含量高于赤芝,這表明熱帶靈芝對(duì)鍺元素的富集能力更強(qiáng)[11]。
劉國(guó)民等[11]采用MS(輕唾瓊脂培養(yǎng)基),加入肌醇100 mg·L-1、煙酸0.5 mg·L-1、鹽酸硫胺素2.0 mg·L-1、鹽酸吡哆素1.0 mg·L-1、甘氨酸 2.0 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1、IBA 1.0 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1,pH 5.8 條件下能夠培養(yǎng)熱帶靈芝。Law[12]通過(guò)對(duì)5種培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比,得出在25℃的大豆提取物中培養(yǎng)15 d熱帶靈芝菌絲體,能夠獲得最高水平的菌絲體量和多糖產(chǎn)量。同時(shí)Tong等[13]還證實(shí),在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中加入不同濃度的Ge元素,隨著添加Ge元素含量的增加,菌絲對(duì)Ge的利用也增加,菌絲中Ge元素的含量也隨之增加。
已有文獻(xiàn)報(bào)道,熱帶靈芝中主要含有多糖、三萜、蛋白質(zhì)以及微量元素等4種物質(zhì),具體情況見(jiàn)表2。
表2 熱帶靈芝化學(xué)成分與藥理活性
續(xù)表
在熱帶靈芝的總糖含量研究中,鄧軍等[10]采用蒽酮法,在共同栽培對(duì)比試驗(yàn)中,熱帶靈芝子實(shí)體的水溶性多糖含量約為赤芝子實(shí)體的1/4,多糖含量為0.408%。Buon[12]對(duì)熱帶靈芝中糖的分子量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果為27 000 Da。Aryantha等[16]采用TLC法對(duì)酸水解后的熱帶靈芝與赤芝的單糖進(jìn)行了對(duì)比,兩者均含有不同濃度的葡萄糖、半乳糖、木糖和鼠李糖。之后,Xin等[18]采用HPTLC法,對(duì)酸水解后的熱帶靈芝進(jìn)行分析,熱帶靈芝子實(shí)體含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、巖藻糖和葡糖醛酸。
Aryantha等[16]于2001年報(bào)道,用三氯化銻和利伯曼-布夏德試劑分別作顯色劑,顯色后在366 nm紫外下對(duì)相同條件培養(yǎng)得到的赤芝和熱帶靈芝子實(shí)體進(jìn)行TLC對(duì)比分析,熱帶靈芝與赤芝的三萜類成分類似,并且與赤芝相比,熱帶靈芝含有更多種類的三萜類物質(zhì)。同年,Su等[21]通過(guò)HPLC法,使用Lichrosphere 100 C-18 column(300 mm ×4.6 mm,5 μm)色譜柱對(duì)6種不同產(chǎn)地的熱帶靈芝中的靈芝酸B、C2含量進(jìn)行測(cè)定,含量分別為 0.0940 mg·g-1~ 0.143 3 mg·g-1和0.0312 mg·g-1~ 0.1052 mg·g-1。2006 年,Wang 等[20]采用HPLC法也對(duì)福州產(chǎn)地的熱帶靈芝中6種靈芝酸含量進(jìn)行測(cè)定,這是目前為止對(duì)熱帶靈芝中三萜類成分最完全的定性及定量報(bào)道。2013年,Hu等[24]首次對(duì)熱帶靈芝子實(shí)體中的醇提物進(jìn)行分離,得到3種羊毛甾醇型三萜類物質(zhì),分別為3β,7β,15β-三羥基-11,23-二氧代羊毛脂 -8,16-二烯-26酸、3β,7β,15β-三羥基-11,23-二氧代羊毛脂-8,16-二烯-26-酸甲基酯、3β,15β-二羥基-7,11,23-三氧代羊毛脂-8,16-二烯-26酸甲基酯 (圖2)。
鄧軍等[10]采用鹽酸水解法,使用氨基酸分析儀對(duì)栽培得到的熱帶靈芝子實(shí)體進(jìn)行定量分析,熱帶靈芝與赤芝相同,均含有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等17種氨基酸,其中含有賴氨酸、蛋氨酸等9種人體必需氨基酸,且含量是赤芝的2倍左右,他們還對(duì)熱帶靈芝中礦質(zhì)元素進(jìn)行原子吸收分析,證明熱帶靈芝中含有Ge、Cu、Fe等礦質(zhì)元素。另外,Aryantha[16]曾報(bào)道猜測(cè)熱帶靈芝中含有麥角甾醇。
在熱帶靈芝的藥理活性研究中,抗腫瘤、保肝、降血糖等研究均有報(bào)道。在熱帶靈芝抗腫瘤作用研究中,Choong等[14]對(duì)赤芝、熱帶靈芝以及松杉靈芝 (Ganoderma tsugae)藥理活性對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),熱帶靈芝菌絲體水提物對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性,但能夠誘導(dǎo)人體乳腺癌細(xì)胞MDAMB-435凋亡和壞死。熱帶靈芝的水提物也具有誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡作用,Sadava等[15]研究指出,其主要作用機(jī)理是其水提物能夠提升含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的活性,而含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶能夠作用在半胱氨酸殘基,它選擇性地切割蛋白質(zhì)進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡。
在熱帶靈芝保肝研究領(lǐng)域,臺(tái)北醫(yī)學(xué)大學(xué)楊依珍以四氯化碳誘發(fā)小白鼠急性肝障礙的模式,并以谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)及組織切片的方法來(lái)評(píng)估18種靈芝類物質(zhì)中三萜類對(duì)急性肝障礙的效果。結(jié)果證明,熱帶靈芝在以相同劑量加藥3次后,排除肝障礙的效果最好[34]。
Bastami等[35]報(bào)道熱帶靈芝具有調(diào)節(jié)胰島素分泌和降血糖作用,在口服葡萄糖耐藥試驗(yàn)中,1 g·kg-1體重的粗提物就顯示明顯的降低血糖作用;熱帶靈芝粗提物對(duì)大鼠胰腺β-細(xì)胞系的 IC50值為100 μg·mL-1;在30 min的急性胰島素分泌測(cè)試中,熱帶靈芝粗提物也顯示出具有提高胰島素分泌的作用,這些結(jié)果都表明,熱帶靈芝粗提物具有升高胰島素和降低血糖活性的作用。
另外,Hu等[24]分離出的化合物3β,7β,15β-三羥基-11,23-二氧代羊毛脂-8,16-二烯-26-酸甲基酯,被證明具有一定的乙酰膽堿酶活性抑制作用。而乙酰膽堿與心血管系統(tǒng)存在重要的相互作用。人的腦組織中有大量的乙酰膽堿,隨著年齡的增加,乙酰膽堿的含量會(huì)減少,繼而容易誘發(fā)帕金斯癥、阿爾茨海默病等疾病,抑制乙酰膽堿酶,可以延緩乙酰膽堿的減少,提高人腦內(nèi)的乙酰膽堿含量,促進(jìn)腦神經(jīng)傳導(dǎo)功能,改善腦功能,提高記憶力[36,37]。
一直以來(lái),靈芝都是中藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),但研究多集中在赤芝和紫芝 (Ganoderma sinense)2種靈芝上。近幾年來(lái),越來(lái)越多的研究工作者已經(jīng)開(kāi)始了靈芝屬其它種類靈芝的研究,除了對(duì)熱帶靈芝的研究之外,如Huang等[38]對(duì)于松杉靈芝對(duì)肝損失保護(hù)和Yu等[39]對(duì)松杉靈芝抗肺癌的研究也都顯示出較好的藥理活性。僅從目前的研究結(jié)果來(lái)說(shuō),熱帶靈芝具有與赤芝相似的化學(xué)成分及相似的藥理活性[40],并且在治療急性肝障礙[34]等方面較赤芝有更好藥理活性,具有很高的研究?jī)r(jià)值。但是,目前對(duì)熱帶靈芝的研究遠(yuǎn)不如赤芝和紫芝深入,有很多方面包括藥理活性、發(fā)酵培養(yǎng)、化學(xué)成分及分析方法等都值得進(jìn)一步深入研究。例如,一方面增加其藥理活性方面的研究,如熱帶靈芝是否同赤芝一樣,具有免疫調(diào)節(jié)作用[41]、抗病毒、抗衰老[42]等藥理作用;另一方面,可以在熱帶靈芝菌絲體液體發(fā)酵方面進(jìn)行研究,以更快捷廉價(jià)地獲得靈芝活性成分,確定熱帶靈芝的品質(zhì)控制方法并保障其質(zhì)量。
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