于 群， 王惠民， 季伙燕， 蘇建友， 叢 輝， 顧國浩， 沈國榮

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，江蘇南通226001;2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州215006;3.南通大學(xué)附屬吳江醫(yī)院檢驗科，江蘇吳江215200)

低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)在密度、顆粒大小及化學(xué)組成等方面具有明顯異質(zhì)性。從顆粒大小方面分析，LDL主要分為兩大類:一類顆粒較大、密度較小，稱大而輕 LDL(large buoyant LDL，lbLDL);另一類顆粒較小、密度較大，稱為小而密 LDL(small dense LDL，sdLDL)。近年來，各種研究發(fā)現(xiàn)sdLDL與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。sdLDL與冠心病(coronary heart disease，CHD)的關(guān)系愈來愈受到人們的關(guān)注。目前sdLDL的主要檢測方法有密度梯度超速離心法、梯度凝膠電泳法［1-2］，前者所用儀器昂貴、所需時間長，后者操作繁瑣、分析速度慢。其他檢測方法還有質(zhì)子核磁共振光譜法［3］、體積排阻色譜法［4］、動態(tài)光散射法［5］以及微流控芯片電泳分離法［6］等，但都存在儀器復(fù)雜、操作繁瑣等不足。我們通過篩選合適的沉淀劑并對沉淀條件進行優(yōu)化，建立了更適用于常規(guī)實驗室分離檢測sdLDL的方法。

材料和方法

一、儀器

美國Beckman-Coulter公司Allegra 64R臺式高速冷凍離心機，日立7600-020型全自動生化分析儀。

二、試劑

磷鎢酸鈉(批號F20070403)、氯化錳(MnCl2)(批號F20090224)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，氯化鎂(MgCl2)(批號071115)、無水氯化鈣(CaCl2)(批號071115)購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，肝素鈉(批號1012110)購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，硫酸葡聚糖鈉鹽(DSS)(批號HGC01)購于東京化成工業(yè)株式會社;血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑由上海北海生物技術(shù)工程有限公司提供。

三、樣本來源

選擇南通大學(xué)附屬醫(yī)院就診患者，空腹安靜狀態(tài)下采集靜脈血2 mL，1 h內(nèi)分離血清作為待測樣本。

四、sdLDL化學(xué)沉淀法測定過程

將200μL血清和200μL沉淀劑依次加入離心管中混勻，37℃水浴10 min后冰浴15 min，然后于4℃，16 600 rpm離心15 min。此時，上清液中含sdLDL，下層沉淀含lbLDL、極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)。使用全自動生化分析儀檢測上清液中LDL-C含量即為血清中sdLDL-C含量。

五、沉淀劑的選擇和優(yōu)化

1.沉淀劑的篩選 分別用4種沉淀劑［7］［磷鎢酸-Ca2+(0.3%-15 mmol/L);硫酸葡聚糖(DS)-Mg2+(1.5%-40 mmol/L);肝素-Mn2+(40 U/mL-30 mmol/L);肝素-Mg2+(150 U/mL-90 mmol/L)］處理1組血脂正常血清和2組血脂升高血清。使用全自動生化分析儀測定上清液中 TC、TG、HDL-C和LDL-C，考察沉淀效果。

2.沉淀劑濃度的選擇 選擇合適的沉淀劑，考察不同濃度沉淀劑的沉淀效果。

3.精密度檢測 將sdLDL-C濃度為0.47和0.99 mmol/L的混合血清用化學(xué)沉淀法分別連續(xù)檢測20次，計算批內(nèi)CV;將sdLDL-C濃度為0.31和0.82 mmol/L的混合血清用化學(xué)沉淀法分別連續(xù)檢測20 d，計算批間CV。

4.線性試驗 將sdLDL-C高值血清樣本(濃度為1.44 mmol/L)用生理鹽水作梯度稀釋，使含血清分別為1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10及原血清，用化學(xué)沉淀法測定sdLDL-C濃度，分析其線性范圍。

5.回收率 取sdLDL-C濃度為0.210 mmol/L的血清20μL，加入180μL sdLDL-C濃度為0.297 mmol/L的血清。用化學(xué)沉淀法測定樣本中sdLDL-C濃度，計算回收率。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、最佳沉淀劑和最優(yōu)沉淀劑濃度

1.最佳沉淀劑 分別用磷鎢酸-Ca2+(0.3%-15 mmol/L)、DS-Mg2+(1.5%-40 mmol/L)、肝素-Mn2+(40 U/mL-30 mmol/L)和肝素-Mg2+(150 U/mL-90 mmol/L)處理1組血脂正常血清和2組血脂升高血清，4種沉淀劑沉淀效果見圖1。肝素-Mg2+(150 U/mL-90 mmol/L)作為沉淀劑時效果最好，2組血脂升高組sdLDL-C濃度分別是正常組的2.42和2.02倍。

2.最優(yōu)沉淀劑濃度 沉淀劑中肝素濃度初定為150 U/mL，Mg2+濃度在40～90 mmol/L范圍內(nèi)10 mmol/L遞進，處理血脂正常和血脂升高2組血清，測定上清液中TC、TG、HDL-C和LDL-C，沉淀效果見圖2。Mg2+濃度為40、50 mmol/L時無法沉淀脂蛋白;90 mmol/L時沉淀效果最好，血脂升高組sdLDL-C濃度是正常組的2.40倍。沉淀劑中Mg2+濃度為90 mmol/L，肝素濃度在25～225 U/mL范圍內(nèi)以25 U/mL遞進，處理血脂正常和血脂升高2組血清，測定上清液中TC、TG、HDL-C和LDL-C，沉淀效果見圖3。肝素濃度為25、50、75 U/mL時無法沉淀脂蛋白;150 U/mL時沉淀效果最好，血脂升高組sdLDL-C濃度是正常組的3.79倍。由于上述試驗中肝素濃度在150～175 U/mL時上清液中sdLDL-C濃度變化幅度較大。為優(yōu)化沉淀條件，再次調(diào)整肝素濃度，選擇肝素濃度在120～180 U/mL范圍內(nèi)以10 U/mL遞進，沉淀效果見圖4。肝素濃度為140 U/mL時沉淀效果最好，血脂升高組sdLDL-C濃度是正常組的2.17倍。因此，最終選擇140 U/mL肝素-90 mmol/L Mg2+作為沉淀劑。

圖1 4種沉淀劑沉淀效果比較

圖2 40～90 mmol/L Mg2++150 U/mL肝素沉淀效果比較

圖3 25～225 U/mL肝素+90 mmol/L Mg2+沉淀效果比較

圖4 120～180 U/mL肝素+90 mmol/L Mg2+沉淀效果比較

二、精密度

本法測定血清sdLDL-C的批內(nèi)CV分別為2.83%、3.19%，批間 CV 分別為5.49%、6.13%。

三、線性范圍

本法測定sdLDL-C 在0.14～1.44 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=1.025X-0.197，r=0.988。

四、回收率

本法測定sdLDL-C的回收率為83.81%。

討 論

近年來，眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，sdLDL在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，是冠心病的危險因子［8］。如何建立快速、簡便的sdLDL檢測方法也成為國內(nèi)外許多專家學(xué)者研究的熱點。但目前sdLDL的檢測方法多由于需要特殊儀器設(shè)備或操作過程繁瑣等不足難以在臨床常規(guī)實驗室推廣使用。國外有關(guān)sdLDL化學(xué)沉淀法已有報道［9-10］，國內(nèi)雖有采用化學(xué)沉淀法測定 sdLDL的報道［11-12］，但大多直接引用國外方法。

本研究根據(jù)聚陰離子與二價陽離子組合可選擇性沉淀密度＜1.044 g/mL的脂蛋白，比較了4種沉淀劑的沉淀效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)140 U/mL肝素-90 mmol/L Mg2+作為沉淀劑較使用其他3種沉淀劑或其他濃度肝素-Mg2+能更有效地區(qū)分血脂升高組與正常組的sdLDL-C濃度。因此，最終選擇140 U/mL肝素-90 mmol/L Mg2+作為沉淀劑。

本研究顯示化學(xué)沉淀法測定sdLDL-C批內(nèi)、批間重復(fù)性均較好，且此法在檢測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，樣本回收率為83.81%。由于實驗條件有限，本研究尚未將化學(xué)沉淀法與密度梯度超速離心法比較，但Hirano等［7］已證實化學(xué)沉淀法與密度梯度超速離心法有很好的相關(guān)性(Y=1.049X+1，r=0.884，P＜0.000 1)。Hirano等［7］使用150 U/mL 肝素-90 mmol/L Mg2+作為沉淀劑，與本研究所述化學(xué)沉淀法在肝素濃度上存在差異，可能與實驗具體條件差異以及血清樣本來源的種族差異有關(guān)。

與密度梯度超速離心法、梯度凝膠電泳法等比較，化學(xué)沉淀法具有不需特殊儀器設(shè)備、樣本用量少、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點，更適合常規(guī)實驗室檢測血清sdLDL-C含量。化學(xué)沉淀法的研究與應(yīng)用將有力推動sdLDL臨床價值的研究。

［1］Winkler K，Jacob S，Müller-Schewe T，etal.Ezetimibe alone and in combination lowers the concentration of small，dense low-density lipoproteins in type 2 diabetes mellitus［J］.Atherosclerosis，2012，220(1):189-193.

［2］Ba?uls C，Bellod L，Jover A，etal.Comparability of two different polyacrylamide gel electrophoresis methods for the classification of LDL pattern type［J］.Clin Chim Acta，2012，413(1-2):251-257.

［3］Decewicz DJ，Neatrour DM，Burke A，etal.Effects of cardiovascular lifestyle change on lipoprotein subclass profiles defined by nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.Lipids Health Dis，2009，8:26.

［4］Lu M，Gantz DL，Herscovitz H，etal.Kinetic analysis of thermal stability of human low density lipoproteins:a model for LDL fusion in atherogenesis［J］.J Lipid Res，2012，53(10):2175-2185.

［5］Sakurai T，Trirongjitmoah S，Nishibata Y，etal.Measurement of lipoprotein particle sizes using dynamic light scattering［J］.Ann Clin Biochem，2010，47(Pt 5):476-481.

［6］Wang H，Wang HM，Jin QH，etal.Microchip-based small，dense low-density lipoproteins assay for coronary heart disease risk assessment［J］.Electrophoresis，2008，29(9):1932-1941.

［7］Hirano T，Ito Y，Saegusa H，etal.A novel and simple method for quantification of small，dense LDL［J］.J Lipid Res，2003，44(11):2193-2201.

［8］Sharma SB，Garg S.Small dense LDL:risk factor for coronary artery disease(CAD)and its therapeutic modulation［J］.Indian J Biochem Biophys，2012，49(2):77-85.

［9 ］Ito Y，Hirano T，Yamazaki J，etal.New simple method for small，dense LDL:development of a new quantification method and clinical significance［J］.Rinsho Byori，2004，52(5):406-413.

［10］Hirano T，Ito Y，Koba S，etal.Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol levels determined by the simple precipitation method［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(3):558-563.

［11］張正清，王連升，莊 興，等.血清三酰甘油水平與小而密低密度脂蛋白膽固醇的關(guān)系［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26(12):802-805.

［12］閔 芳，吳 嘉，牛冬梅，等.小而密低密度脂蛋白膽固醇直接測定法與肝素鎂沉淀法的比較［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(4):73-75.