王艷海， 段寶生， 巴特爾， 張 靜， 趙 娜

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學鄂爾多斯臨床醫(yī)學院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是臨床常見的重要病原菌，具有多重耐藥性，由其引起的臨床感染所占的比例呈逐年上升的趨勢，給臨床治療帶來極大困難。MRSA的致病能力強，可引起菌血癥、敗血癥、中毒休克綜合征等多種進行性、壞死性疾?。?-2］。來自全球監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示MRSA的發(fā)生率達40%～50%，而且不同種族、不同地區(qū)來源的MRSA在致病性、耐藥性及基因多態(tài)性等方面有顯著差異［3］。因此，了解各民族、各地區(qū)MRSA的分子流行特征為制定預防措施及有效防止MRSA的爆發(fā)流行具有十分重要的意義。本研究通過葡萄球菌染色體mec(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCC mec)基因分型、多位點序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)及殺白細胞毒素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)毒力基因(pvl)檢測等技術，對鄂爾多斯地區(qū)蒙古族54株MRSA菌株進行基因分型研究，同時與主要流行克隆株進行比較和分析，以了解本地區(qū)MRSA的分子生物學特征。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源 收集2009年1月至2011年8月在鄂爾多斯市中心醫(yī)院門診及住院的蒙古族患者，連續(xù)分離不重復血、腹腔滲出液、封閉膿汁、下呼吸道痰標本、支氣管灌洗液以及尿液、傷口分泌物等標本MRSA分離株共54株，均經(jīng)VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定，同時使用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)［4］推薦的頭孢西丁紙片擴散法驗證MRSA，判讀標準:抑菌圈直徑≤19 mm。mecA基因檢測均陽性。金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)質(zhì)控菌株購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

2.儀器與試劑 美國貝克曼公司的超速低溫離心機;美國Alpha Innotech有限公司的紫外凝膠成像儀;Gene Amp基因有限公司 PCR9700;BIO-RAD電泳儀;細菌基因組提取試劑盒購于上海生物工程有限公司;Taq酶、Marker及聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)相關試劑購于寶泰克生物科技有限公司;PCR所有引物均由上海生工生物技術有限公司合成。

二、方法

1.細菌基因組提取 采用上海生物工程有限公司的細菌基因組提取試劑盒，依照說明提取基因組DNA，產(chǎn)物保存－70℃冰箱中備用。

2.SCC mec基因分型 多重PCR引物及反應體系等參數(shù)參照文獻［5］進行。使用Gene Amp基因有限公司PCR9700進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色，紫外凝膠成像儀觀察是否出現(xiàn)目的條帶，并拍照成像。PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術公司純化并雙向測序，測序結(jié)果在網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nih.gov/)進行BLAST對比，明確其基因型。

3.PVL毒力基因檢測 每株MRSA均PCR進行毒力篩查，引物及反應體系等參數(shù)參照文獻［6］，基因片段位于第1 640～2 072位點，擴增產(chǎn)物為433 bp。擴增產(chǎn)物電泳后全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。擴增陽性產(chǎn)物送上海生工生物技術公司測序。

4.MLST 7個管家基因分別是 arcc、aroe、glp、guk、pta、tpi和 yqil，其擴增引物及反應參數(shù)參照文獻［7］進行。電泳、測序、序列比對同前，測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行比對后，將結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net)，比較每個多態(tài)性位點的等位基因，獲得序列號(ST)，并與已知的MRSA流行株進行比較和分析。

結(jié) 果

一、SCC mec分型結(jié)果

對鄂爾多斯地區(qū)蒙古族54株MRSA菌株進行SCC mec基因分型，SCC mecⅡ型 27株，占50.00%，SCC mecⅢ型 25 株，占 46.30%;SCC mecⅣ型 1株，占1.85%;SCC mecⅤ型 1株，占1.85%;未檢測到SCC mecⅠ型菌株。Ⅱ～Ⅴ型測序結(jié)果與GenBank BLAST比對，結(jié)果分別與參考序列D86934、AB37671、AB063172、AB12121一致。SCC mecⅤ型代表菌株測序圖譜見圖1。

二、pvl基因檢測結(jié)果

54株MRSA均進行了pvl基因的PCR擴增，結(jié)果顯示僅1株SCCmecⅣ型MRSA菌株的pvl基因陽性，分離率為1.85%，代表株測序圖譜見圖2，其余菌株均為陰性。

三、MLST結(jié)果

挑選27株 MRSA進行 MLST分型，其中SCC mecⅢ型14株，SCC mecⅡ型11株，SCC mecⅣ型1株，SCC mecⅤ型1株。有24株MRSA成功進行分型，其中有1株 SCC mecⅢ型和2株SCC mecⅡ型未能進行MLST分型。24株MRSA共有 4種序列型，其中 13株為ST239，占54.17%;9株為ST5，占 37.50%;ST59和 ST7 各1株，占4.17%。通過eBURST軟件繪制了所測試的24株菌株和不同ST型別之間的系統(tǒng)進化樹，見圖3～圖5。同時，SCC mec基因型與MLST分型結(jié)果之間具有一定的關聯(lián)性，見表1。

圖1 MRSA菌株SCC mecⅤ型測序序列圖譜

圖2 MRSA菌株pvl基因測序序列圖譜

圖3 ST239的克隆復合體分析圖譜

圖4 ST5的克隆復合體分析圖譜

圖5 ST59的克隆復合體分析圖譜

表1 SCC mec基因型與MLST分型的對應關系

討 論

1961年Jevons在英國首次發(fā)現(xiàn)MRSA，20世紀60年代中期MRSA擴展到歐洲許多國家及加拿大，20世紀70年代末急劇增多遍及全世界，并引起爆發(fā)流行，成為全球性問題［8］。不同國家、不同地區(qū)間流行的 MRSA基因型不同，目前SCC mec分型成為最常用的分型方法之一，已經(jīng)廣泛應用于科學研究，依照SCC mec各基因組分的多態(tài)性將SCC mec分為Ⅰ～XI型［9］，根據(jù)無功能區(qū)的不同又可以分為不同的亞型。本研究對鄂爾多斯地區(qū)蒙古族患者進行SCC mec分型，結(jié)果顯示SCC mecⅡ型和Ⅲ型是本地區(qū)的主要型別，分別占50.00%和46.30%。這與國內(nèi)、外相關報道相近［10-11］，表明本地區(qū)蒙古族人群MRSA分子流行病學特征仍與主要流行株一致。在治療方面，有國內(nèi)外相關經(jīng)驗可以借鑒，如吳愛武報道的MRSA對克林霉素、β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物100%耐藥，而對其他藥物表現(xiàn)為多重耐藥［12］。本研究還發(fā)現(xiàn)Ⅳ型和Ⅴ型各1例菌株，特別是Ⅴ型在國內(nèi)蒙古族人群中很少見到報道，但Ⅳ型和Ⅴ型在歐洲某些國家為主要表型［13］，表明與國外流行株有交叉，原因可能與鄂爾多斯地區(qū)的地理位置與蒙古國毗鄰及其過快的發(fā)展速度有關，導致來源于世界流行株在本地區(qū)攜帶傳播。隨著國家和地區(qū)間經(jīng)濟文化交流的日益頻繁，感染更具有復雜性和多樣性。同時，有研究報道SCC mec分型是區(qū)分醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的一個重要指標，但是本地區(qū)蒙古族人群及門診標本較分散，不利于調(diào)查隨訪，而且社區(qū)獲得性感染標準國際與我國尚未統(tǒng)一，不利于區(qū)分。因此，我們應該通過加大樣本量等措施，進一步探明本地區(qū)社區(qū)獲得性感染MRSA流行株的SCC mec型別、分布情況及抗菌藥物耐藥的攜帶情況，這有待我們進一步研究探討。

PVL是一種與致病力相關的外毒素，能與葡萄球菌細胞表面結(jié)合，直接導致皮膚及軟組織感染、壞死性肺炎、壞死性筋膜炎等嚴重壞死性疾?。?4］，對MRSA進行 pvl基因檢測尤其重要。本研究對所有MRSA進行了pvl基因的PCR擴增，結(jié)果顯示僅1株MRSA的pvl基因陽性，其他均未檢出pvl基因，可能與pvl基因為社區(qū)獲得性感染特有的標志有關。有研究顯示，世界上流行的社區(qū)獲得性感染MRSA產(chǎn)pvl的比例高達77%～100%［15］，而在醫(yī)院感染MRSA中pvl基因的檢出率＜0.5%。又如 Zhang等［5］進行相關研究，發(fā)現(xiàn)所有117株社區(qū)獲得性感染MRSA均包含pvl基因，而醫(yī)院MRSA菌株pvl基因均未檢測出。本次研究中，pvl基因擴增陽性率較低的原因，可能和地域特征及民族特征有一定的關系，不同地區(qū)、不同民族的陽性率可能也不同［16］。同時本研究發(fā)現(xiàn)的pvl陽性菌株是SCC mecⅣ型，這也揭示pvl陰陽性結(jié)果可以初步作為區(qū)分社區(qū)獲得性感染MRSA和醫(yī)院感染MRSA標準之一，因為Ⅳ、Ⅴ型多見于社區(qū)獲得性感染MRSA［17］。

目前，國際上主要有5個MRSA克隆株［18］，包括巴西/匈牙利克隆株、伊比利亞克隆株、紐約/日本克隆株及兒童克隆株。本研究通過對24株MRSA菌株進行MLST，總共發(fā)現(xiàn)4個不同的ST型，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)MRSA菌株主要由兩大克隆株進化而來，一個為SCC mecⅢ-ST239，歸屬于CC8克隆復合體，來源于巴西/匈牙利克隆株，是亞洲地區(qū)亦是國內(nèi)其他地區(qū)廣泛流行的克隆株;另一個為SCC mecⅡ-ST5，歸屬于CC5克隆復合體，來源于紐約/日本克隆株，是在韓國和日本廣泛流行的克隆株;另外本地區(qū)的Ⅳ型菌株為SCC mecⅣ-ST59，歸屬于CC59克隆復合體，與美國、新加坡及中國臺灣地區(qū)廣泛傳播的社區(qū)獲得性感染MRSA克隆株相同［19］，考慮為輸入性病例引發(fā)疾病所致;SCC mecⅤ型菌株為ST7型，因數(shù)據(jù)有限，尚無法追蹤其根源。

綜上所述，本研究通過SCC mec分型、pvl基因檢測及MLST 3種方法，發(fā)現(xiàn)鄂爾多斯地區(qū)蒙古族人群MRSA并非是單一流行株，而以SCC mecⅢ型和SCC mecⅡ型兩大克隆株為主，另外近年來在歐美地區(qū)迅速流行的SCC mecⅣ、Ⅴ型菌株也已經(jīng)通過各種途徑傳播到本地區(qū)。本研究不足之處在于社區(qū)獲得性感染MRSA患者多在門診或急診科就診，通常患者僅僅進行簡單的外科處理或經(jīng)驗性用藥，很少送檢，造成檢出率較低，而且毒力基因的檢測僅局限于pvl，而沒有對其他毒力基因如hla、hlb、clf及fnb等進行檢測。另外，進行MLST分型的菌株數(shù)量較少，均有待于我們進一步完善研究。

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