齊希光，李秀芬

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)2(江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)

我國是醬油生產(chǎn)及消費大國，僅2010年，就產(chǎn)生了約470萬t的醬渣(含水75%)。醬渣是指釀造醬油原料經(jīng)制曲、發(fā)酵、淋出醬油后產(chǎn)生的固體殘渣。醬渣(干基)中含有約20%～30%粗蛋白、7%～18%粗脂肪、10%以上碳水化合物、20%～24%粗纖維、8%～12%水分、0.5%～2%鹽分和豐富的礦物質(zhì)，再利用價值很高。目前，醬渣主要是用作肥料和飼料，但由于含鹽度高，用量受到限制［1］。而其回收利用和深度加工尚處于研究階段，主要集中在提取油脂、膳食纖維、黃酮和鮮味劑等成分，研究結(jié)果尚不理想。

有機廢棄物厭氧發(fā)酵會產(chǎn)生多種揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，如乙酸、丁酸等，可作為發(fā)酵工業(yè)原料生產(chǎn)高附加值的發(fā)酵產(chǎn)品(如角質(zhì)酶)，或作為化工原料合成其他產(chǎn)品(如聚乳酸)。研究表明［2］，厭氧生物處理過程中基質(zhì)與微生物之比(F/M)對其進程影響很大。一般來說，較高的F/M可獲得較多的產(chǎn)物，但轉(zhuǎn)化率較低，高濃度底物也可能對產(chǎn)酸具有抑制作用。Ginkel等［3］研究發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵底物葡萄糖濃度為10～30 g/L時，產(chǎn)生的有機酸質(zhì)量占總酸化產(chǎn)物的比例高達90%以上，而當葡萄糖濃度上升至40 g/L時，比例降低到38%。而較低的F/M同樣會降低有機酸的產(chǎn)量。

目前，生物質(zhì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的研究主要集中在污水處理廠污泥、餐廚垃圾、藍藻等的處理，而有關(guān)醬渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸研究報道鮮見。通過優(yōu)化醬渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的F/M，將醬渣中的有機成分盡可能多地轉(zhuǎn)化成乙酸等揮發(fā)性脂肪酸，可在實現(xiàn)醬渣減量化的同時，生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及操作條件

醬渣(江蘇某釀造廠)溶液濃度為100 g/L，用4 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0，90℃預(yù)處理2 h，離心后的上清液作為發(fā)酵產(chǎn)酸的底物。其中，可溶性蛋白質(zhì)和碳水化合物的濃度分別為3.5～5.0 g/L和3.0～4.0 g/L。接種污泥為無錫市某污水處理廠的消化污泥，其VS/TS為62.90%。將此污泥放入有效容積為2 L的UASB反應(yīng)器中馴化［4］，所得酸化接種污泥的VS/TS為78.10%。初始發(fā)酵pH值為9.0，F(xiàn)/M(即醬渣預(yù)處理液與接種污泥質(zhì)量之比)分別為 1∶0，1∶1，3∶1，5∶1，10∶1，20∶1和 50∶1。充 3 min氮氣后用橡膠塞密封，放入120 r/min的搖床中厭氧發(fā)酵 10 d［5－6］，發(fā)酵溫度為 35 ℃。

1.2 分析測試項目及方法

1.2.1 VFA的濃度

測定前樣品預(yù)處理:取5 mL厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，用0.45 μm的微濾膜過濾，取濾液0.5 mL于離心管中，加入同體積0.835 g/L的4-甲基戊酸溶液(作為內(nèi)標)和同體積3 mol/L的磷酸溶液(促使溶液中的VFA在進樣室內(nèi)氣化)，混勻，再次8 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液裝入氣相色譜進樣瓶，進島津2010氣相色譜儀檢測。氣相色譜測定參數(shù):AOC-20i自動進樣器;FID檢測器;PEG-20M毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm，大連中匯達科學(xué)儀器有限公司);采用一階程序升溫，初溫80℃，保持3 min，后以15℃/min的速率升至210℃，保持2 min。進樣室和檢測器的溫度都設(shè)為250℃。

1.2.2 蛋白酶的活性

蛋白酶活性的測定根據(jù)GB/T23527－2009方法進行，即利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸與福林-酚試劑的顯色反應(yīng)，來間接測定蛋白酶的活力。具體步驟為:A.將樣品組(包括1 mL酶樣即離心后上清液和1mL 10 mg/mL的酪素溶液)和空白組(1 mL酶樣和2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸)40℃加熱10 min。B.在樣品組加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，向空白組加入1mL 10 mg/mL的酪素溶液，靜置10 min后過濾。C.各取濾液1 mL，分別加5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL福林-酚試劑，40℃顯色20 min后，680 nm吸光度下比色。1 mL酶樣在40℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5)條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性需分別測定，酪素溶液也分別用乳酸緩沖液(pH=3.0)、磷酸緩沖液(pH=7.5)和硼酸緩沖液(pH=10.5)配制。

1.2.3 α-淀粉酶的活性

淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5-二硝基水楊酸試劑測定，麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸還原成3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色物質(zhì))，其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時間(1 min)內(nèi)生成麥芽糖的質(zhì)量(mg)表示淀粉酶活性的大小。具體步驟為:(1)樣品組和空白組都包括有1 mL的酶液，首先在70℃恒溫水浴中(水浴溫度的變化不應(yīng)超過±0.5℃)加熱15 min，在此期間β-淀粉酶鈍化。(2)取出后，迅速在水浴中徹底冷卻。(3)樣品組和空白組各加入1 mL pH 5.6檸檬酸緩沖液。(4)向空白組中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以鈍化酶的活性。(5)將樣品組和空白組置于40℃(±0.5℃)恒溫水浴中準確保溫15 min。(6)分別加入40℃下預(yù)熱的1% 的淀粉溶液2 mL，搖勻，立即放入40℃水浴中準確保溫5 min。(7)取出后，向樣品組迅速加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以終止酶的活性，然后準備下一步糖的測定。(8)取以上樣品組中酶作用后的溶液及空白組中的溶液各1 mL，分別放入15 mL具塞刻度管中，再加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑混勻，置于沸水浴中煮沸5 min。(9)冷卻，用蒸餾水稀釋至15 mL，混勻，510 nm吸光度下比色。

1.2.4 其他指標及測定方法

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G250染色法測定［7］;碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法測定［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 F/M對溶解性蛋白質(zhì)和碳水化合物降解的影響

厭氧發(fā)酵10 d后，系統(tǒng)F/M對厭氧發(fā)酵前后可溶性蛋白質(zhì)濃度的影響如圖1所示。系統(tǒng)F/M越低，微生物的相對數(shù)量越多，降解轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)能力越強，所得降解速度越快，在F/M為1∶1時，可溶性蛋白質(zhì)降解率最高，達71.23%。在F/M為1∶0時，即未添加酸化接種污泥時，蛋白質(zhì)也有所降解，這可能是因為環(huán)境中本身存在一定微生物，因此也存在一些代謝活動，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)被降解。不同F(xiàn)/M條件下，發(fā)酵前后可溶性碳水化合物濃度變化如圖2所示?？梢姡現(xiàn)/M對碳水化合物的降解規(guī)律類似蛋白質(zhì)，F(xiàn)/M越低，微生物數(shù)量越多，降解轉(zhuǎn)化碳水化合物的能力越強，同樣，在F/M為1∶1時，碳水化合物降解率最高，達73.43%。在F/M為1∶0時，即未添加酸化接種污泥時，碳水化合物也有所降解，原因同上。

圖1 F/M比對可溶性蛋白質(zhì)降解的影響Fig.1 Influence of F/M on the degradation of soluble proteins

2.2 F/M對蛋白酶活性的影響

圖2 F/M可溶性碳水化合物降解的影響Fig.2 Influence of F/M on the degradation of soluble carbohydrates

水解通常被認為是厭氧發(fā)酵過程中的限速步驟。胞外水解酶能夠加速蛋白質(zhì)和碳水化合物等有機底物水解產(chǎn)酸，因此，胞外水解酶的活性在VFA產(chǎn)生過程中起著重要作用，水解酶的活性可間接反映厭氧酸化的程度。不同F(xiàn)/M條件下，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性隨發(fā)酵時間的變化如圖3、圖4和5所示。可見，隨F/M比降低，蛋白酶活性逐步升高，并在F/M為1∶1時達最大，此時，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性分別為5.336、3.964和4.726 U/mL。較低的F/M意味著接種的酸化污泥量相對較高，產(chǎn)酸微生物的數(shù)量相對較大，其生長代謝分泌的水解蛋白酶相應(yīng)增加，對可溶性蛋白質(zhì)的分解能力相應(yīng)增強。這與之前研究得出的結(jié)論“蛋白質(zhì)降解率在F/M為1∶1時達到最大值”相呼應(yīng)。廢棄醬渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程中酸性、中性和堿性蛋白酶活性的變化趨勢，與張無敵等［9］研究雞糞厭氧消化過程中水解蛋白酶活性的研究結(jié)果及Jones等［10］研究生活垃圾中蛋白質(zhì)等有機質(zhì)發(fā)酵過程蛋白酶活性的變化趨勢均一致。

圖3 F/M對發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性的影響Fig.3 Influence of F/M on the activity of acid-protease

同時可以發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性均隨發(fā)酵時間延長而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，酸性蛋白酶活性在發(fā)酵2 d時達到最大值，中性蛋白酶活性在4 d時達到最大值，而堿性蛋白酶活性的最大值出現(xiàn)在6 d左右。

2.3 F/M對α-淀粉酶活性的影響

圖4 F/M對發(fā)酵過程中中性蛋白酶活性的影響Fig.4 Influence of F/M on the activity of neutral-protease

圖5 F/M對發(fā)酵過程中堿性蛋白酶活性的影響Fig.5 Influence of F/M on the activity of alkaline-protease

α-淀粉酶可用來間接指示碳水化合物的降解程度。F/M對α-淀粉酶活性的影響及其隨時間的變化情況如圖6所示。與蛋白酶活性不同，隨發(fā)酵時間不同，α-淀粉酶活性總體較平穩(wěn)，但仍受系統(tǒng)F/M的影響。當F/M為1∶1時，α-淀粉酶活性都較高，在發(fā)酵時間為144 h時，達14.04 μg maltose/min。較低的F/M條件下，系統(tǒng)中接種酸化污泥提供的產(chǎn)酸微生物數(shù)量較多，分泌水解碳水化合物的酶如α-淀粉酶相應(yīng)增加，對淀粉等碳水化合物的分解能力相應(yīng)增強。這與之前得出的結(jié)論“碳水化合物降解率在F/M為1∶1時達到峰值”相符。α-淀粉酶活性的變化趨勢和Zhang等研究高濃度固體有機廢物水解過程胞外水解淀粉酶活性變化趨勢一致［11］。

圖6 F/M對發(fā)酵過程中α-淀粉酶活性的影響Fig.6 Influence of F/M on the activity of α-amalyse

2.4 F/M對厭氧酸化產(chǎn)物濃度及分布的影響

厭氧發(fā)酵末端產(chǎn)物的分布主要取決于各生態(tài)因子綜合作用下占主導(dǎo)地位的微生物種群的獨立代謝途徑，即一旦環(huán)境條件適于某一種群，該種群就會迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，其生理代謝就決定了發(fā)酵末端產(chǎn)物的類型［2］。VFA是酸化階段的主要產(chǎn)物，乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸可直接由碳水化合物及蛋白質(zhì)發(fā)酵獲得，更高分子量的揮發(fā)性脂肪酸，如正戊酸和異戊酸等主要由蛋白質(zhì)發(fā)酵獲得，因為對不含蛋白質(zhì)的底物進行酸化研究發(fā)現(xiàn)，不生成正戊酸和異戊酸［5］。不同F(xiàn)/M條件下，厭氧酸化產(chǎn)物濃度隨F/M的影響如圖7所示。可見，F(xiàn)/M越高，即底物相對于微生物的含量越高，發(fā)酵結(jié)束時生成的VFA濃度就越大，發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸等，但均以乙酸為主，其次為丙酸和正丁酸。當F/M為1∶0，即未添加酸化污泥時，由于降解有機質(zhì)的微生物很少，在較短的發(fā)酵周期內(nèi)，VFA產(chǎn)量較低。

圖7 F/M對厭氧酸化產(chǎn)物濃度及分布的影響Fig.7 Influence of F/M on the concentration of organic acids and their distribution

Logan等研究發(fā)現(xiàn)，乙酸可作為微生物燃料電池的底物產(chǎn)電［12－13］，乙酸還可化學(xué)合成醋酸乙烯，醋酸乙烯是合成工業(yè)塑料的單體，也可化學(xué)合成醋酸纖維素，再進一步轉(zhuǎn)化為乳膠涂料、色素等［14］，是重要的化工原料。因此，通常希望厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸以乙酸為主。F/M對乙酸占總末端發(fā)酵產(chǎn)物之比的影響如圖8所示。與總酸濃度與F/M的相關(guān)性不同，在F/M為1∶1時，乙酸占總末端發(fā)酵產(chǎn)物比例最高，達82.19%。

圖8 F/M對乙酸占總末端發(fā)酵產(chǎn)物比值的影響Fig.8 Influence of F/M on the percentage of acetatic acid

另外，除乙酸外，相對于其他有機酸，不同F(xiàn)/M條件下，厭氧產(chǎn)酸過程中均存在明顯的丙酸累積現(xiàn)象，F(xiàn)/M為20∶1時，丙酸累積量最高，約為4.00 g/L。在厭氧產(chǎn)甲烷過程中，也常出現(xiàn)丙酸累積現(xiàn)象。有機物的厭氧消化，主要是在水解發(fā)酵產(chǎn)酸菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群等不同微生物類群的協(xié)同作用下逐步完成的。其中，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群將產(chǎn)酸發(fā)酵菌群代謝產(chǎn)生的丙酸、丁酸、乙醇等轉(zhuǎn)化為乙酸、氫氣和二氧化碳。然而，從生化反應(yīng)的能量學(xué)角度分析，丙酸的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝是所有VFA厭氧氧化中最難發(fā)生的反應(yīng)，因在標準狀態(tài)下，丙酸被轉(zhuǎn)化為乙酸反應(yīng)的吉布斯自由能高達 76 kJ/mol［15］，為正值，不能自發(fā)進行，因此，丙酸常在厭氧消化系統(tǒng)中累積［16］。

2.5 F/M對有機酸產(chǎn)量的影響

通常情況下，厭氧發(fā)酵結(jié)束時，有機酸濃度越高，后提取越容易，提取成本越低。然而，從廢物資源化的角度，同時希望原料中的有機物(蛋白質(zhì)和碳水化合物等)能被最大限度的轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)物，不僅可實現(xiàn)廢物的充分減量，同時目標產(chǎn)物的產(chǎn)出率也達到最大。本項研究中，通過調(diào)整醬渣預(yù)處理液與接種污泥的體積之比調(diào)控系統(tǒng)的F/M，并考察其與有機酸產(chǎn)量的關(guān)系，因此，所給醬渣預(yù)處理液即底物的體積不同。以單位體積底物產(chǎn)酸量折算，所得單位體積末端發(fā)酵底物產(chǎn)量及單位體積乙酸產(chǎn)量如圖9和圖10所示?？梢钥闯?，與厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸濃度隨F/M增加而增大不同，在系統(tǒng)F/M為1∶1時，單位體積末端發(fā)酵底物產(chǎn)量及單位體積乙酸產(chǎn)量都是最高的，分別為0.17 g/mL和0.14 g/mL。盡管F/M為50∶1時，最終有機酸及乙酸的濃度最高，但在F/M為1∶1時，有機酸及乙酸的轉(zhuǎn)化率才最大，乙酸在有機酸中的比例也最高。這與各類蛋白酶及α-淀粉酶的活性有關(guān)，此時，各類蛋白酶及α-淀粉酶的活性最大，醬渣預(yù)處理液中蛋白質(zhì)和碳水化合物的降解率最高，因此，有機酸特別是乙酸的產(chǎn)率最高。

圖9 F/M對單位體積預(yù)處理液末端發(fā)酵產(chǎn)物濃度的影響Fig.9 Influence of F/M on the yield of total organic acids

圖10 F/M對單位體積預(yù)處理液乙酸濃度的影響Fig.10 Influence of F/M on the yield of acetic acid

3 結(jié)論

(1)當F/M為1∶1時，醬渣預(yù)處理液中蛋白質(zhì)及碳水化合物的降解率最大，分別為71.23%和73.43%。此時，蛋白酶及α-淀粉酶活性也最高，酸性、中性和堿性蛋白酶及 α-淀粉酶的活性分別為5.336 U/mL、3.964 U/mL、4.726 U/mL 及 14.04 μg maltose/min?？扇苄缘鞍踪|(zhì)在發(fā)酵初期(2 d內(nèi))的轉(zhuǎn)化主要源于酸性蛋白酶的催化降解，酸性蛋白酶的活性對厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程較為關(guān)鍵，之后是中性蛋白酶的催化降解，而在發(fā)酵后期(6 d后)，主要依賴堿性蛋白酶的作用。

(2)當F/M為1∶1時，單位體積的醬渣預(yù)處理液末端發(fā)酵產(chǎn)物的濃度和乙酸濃度均最高，分別為0.17g/mL和0.14g/mL，同時，乙酸占總末端發(fā)酵產(chǎn)物比例也最大，為82.19%。發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸等，但均以乙酸為主，其次為丙酸和正丁酸。不同F(xiàn)/M條件下，厭氧產(chǎn)酸過程中均存在明顯的丙酸累積現(xiàn)象，F(xiàn)/M為20∶1時，丙酸累積量最高，約為4.00 g/L。

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