雷俊華，高群玉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510640)

蠟質(zhì)大米淀粉又稱為糯米淀粉，與其他谷物淀粉相比具有一些特殊的性質(zhì)，比如顆粒非常小(通常3～8 μm)，粒度分布均勻，呈多角形［1］。相比馬鈴薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉，蠟質(zhì)大米淀粉更容易被β-淀粉酶降解［2］。不同淀粉顆粒的大小和形狀，酶解會(huì)有不同的效果，這些差異會(huì)導(dǎo)致不同的水解速率和應(yīng)用性質(zhì)［2］。

β-淀粉酶作為外切酶，不能水解α-l，6葡萄糖苷鍵，也不能越過(guò)分支點(diǎn)繼續(xù)水解，但可以從淀粉的非還原端依次切開(kāi)相隔的α-1，4糖苷鍵，得到麥芽糖單位，促使淀粉鏈長(zhǎng)縮短［3］。水解達(dá)到62%～65%得到的不能繼續(xù)水解的殘留物被稱為β-極限糊精。在國(guó)內(nèi)，有關(guān)β-極限糊精的研究很少，趙燕等研究過(guò)β-淀粉酶水解玉米淀粉制備β-極限糊精并研究過(guò)其物理性質(zhì)［4－5］。在國(guó)外，Ammeraal等從 Dull waxy starch中制得β-極限糊精，并研究了它的一些性質(zhì)和用途［6］。Van der Veen J 等人［7］，采用 β-淀粉酶作用于淀粉，得到β-極限糊精，它是一種改性淀粉聚合體，在水中不溶脹，有很好的黏合性，可充當(dāng)黏合劑。在醫(yī)藥行業(yè)中，β-極限糊精可作麻醉藥的緩釋材料;因其具有潤(rùn)滑作用，會(huì)減弱疏松度的影響，可改善片劑的穩(wěn)定性;在食品行業(yè)中，β-極限糊精可作橡膠糖的增稠劑、飲料的懸濁劑、脂肪替代品等。β-極限糊精水解程度大，產(chǎn)物得率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，為了更好地利用糊精的優(yōu)良性質(zhì)，研究不同水解程度糊精的制備與性質(zhì)具有現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)主要采用β-淀粉酶在一定條件下處理蠟質(zhì)大米淀粉，對(duì)所得不同水解率糊精的顆粒形貌、淀粉-碘吸附結(jié)合物的吸收曲線、相對(duì)分子量溶脹性質(zhì)、透明度等性質(zhì)進(jìn)行研究，為其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質(zhì)大米淀粉，江蘇寶寶集團(tuán);大麥 β-淀粉酶(6 500 U/mL)，日本天野酶制品株式會(huì)社;PHS-3C pH計(jì)，上海三信儀表廠;JJ500型電子天平，常熟市雙節(jié)測(cè)試儀器廠;AM90L-H實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯電動(dòng)攪拌機(jī);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市富華儀器有限公司;TDL-5A離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司;722SP可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司;掃描電子顯微鏡，日立臺(tái)式掃描電子顯微鏡Tm3000;i5紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，濟(jì)南海能儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 糊精的制備

稱取20 g(干基)蠟質(zhì)大米淀粉，用0.1 mol/L pH為5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液制備成20%的淀粉乳，于95℃水浴下加熱糊化30 min，并不停攪拌。糊化完全后降溫至56℃，加入大麥β-淀粉酶(65 U/g)，酶解，在95℃滅酶30 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入100 mL無(wú)水乙醇，以4 000 r/min離心15 min，重復(fù)2次。將所得沉淀物置于45℃的烘箱中，烘干，磨粉過(guò)100目篩即得樣品。將水解 1、3、7、15、20 h 所得的糊精分別標(biāo)記為β－1、β－3、β－7、β－15和β－20。

1.3 酶解淀粉水解率的測(cè)定

在上述反應(yīng)過(guò)程中間隔不同時(shí)間，取1 mL反應(yīng)液，加入無(wú)水乙醇，然后以4 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液加入3 mL DNS試劑充分混勻后沸水浴中加熱煮沸15 min。流水中冷卻后加入21 mL蒸餾水，混勻，以空白對(duì)照550 nm測(cè)吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到麥芽糖的含量。

1.4 淀粉顆粒形態(tài)觀察

將待測(cè)樣品置于105℃的烘箱中干燥4～5 h。在紅外燈下用雙面膠將淀粉樣品固定在樣品臺(tái)上。進(jìn)行噴金處理并將樣品保存于干燥器中。觀測(cè)并拍攝蠟質(zhì)大米原淀粉及其糊精的顆粒形貌。

1.5 淀粉樣品的碘吸附及波長(zhǎng)掃描

稱取0.08 g樣品于20 mL二甲基亞砜中，加熱溶解后取1 mL樣品溶液轉(zhuǎn)移至100 mL蒸餾水中，混勻，靜置。取出3 mL，并加入75 μL 0.2%的碘液，搖勻后立即倒入比色皿中。掃描范圍為450～615 nm，掃描間隔為1 nm，掃描速度為慢速，得到淀粉-碘吸附結(jié)合物的吸收曲線。

1.6 相對(duì)分子質(zhì)量分布

用HPLC對(duì)樣品相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為Shodex KS－806(8 mm×300 mm)，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。樣品配制成3 g/L的溶液，過(guò)0.45 μm的膜，以超純水為流動(dòng)相，進(jìn)樣量20 μL，流速為0.8 mL/min，柱溫70℃，檢測(cè)器溫度為50℃。

1.7 溶解度和膨脹度的測(cè)定

在離心管中配制質(zhì)量濃度為2%的淀粉乳50 mL，然后將其分別置于35、45、55、65、75、85 ℃下加熱30 min，期間振蕩若干次。待其冷卻至室溫后置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心15 min，將上清液于105℃烘至恒重，稱其質(zhì)量為C，離心管中膨脹淀粉的重量為D，計(jì)算溶解度和膨脹度:

式中:C—被溶解的淀粉質(zhì)量，g;M—干基質(zhì)量，g;D—沉淀物質(zhì)量，g。

1.8 透明度

準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品，加蒸餾水配成1 g/mL的淀粉乳，于沸水中加熱糊化15 min，冷卻至室溫。用紫外分光光度計(jì)，以蒸餾水為空白對(duì)照在波長(zhǎng)650 nm處測(cè)糊精的透光率。

1.9 數(shù)據(jù)處理分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)測(cè)定之后的平均值，并用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解淀粉的水解率

如圖1所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉水解率增加，且在水解前期曲線快速上升，然后上升速度變緩并達(dá)到最高水解率56.7%。這是因?yàn)椋?淀粉酶從淀粉分子的非還原性末端斷開(kāi)相隔的α-1，4糖苷鍵，水解前期酶活力較大，隨著時(shí)間的不斷增加，水解淀粉的速度較快，能夠水解出更多的麥芽糖，因此水解率隨之增加。隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，底物減少，且生成的高濃度麥芽糖會(huì)抑制β-淀粉酶的水解作用，因此水解速率降低，直至達(dá)到淀粉水解的極限。于軒［8］用β-淀粉酶對(duì)馬鈴薯淀粉、豌豆淀粉、普通玉米淀粉、木薯淀粉、大米淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉等不同來(lái)源的淀粉進(jìn)行水解，并測(cè)定它們的水解率，與本實(shí)驗(yàn)有相同的趨勢(shì)。

圖1 酶解時(shí)間和水解率的關(guān)系Fig.1 Effect of the enzymatic hydrolysis time on hydrolysis rate

2.2 淀粉的顆粒形態(tài)觀察

利用掃描電子顯微鏡對(duì)淀粉樣品的形貌進(jìn)行研究分析，考察蠟質(zhì)大米淀粉在酶解前后淀粉顆粒的表面微觀結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果如圖2所示。蠟質(zhì)大米淀粉呈多角形，經(jīng)酶解處理后，形狀和顆粒大小都發(fā)生了顯著變化，不再具有原淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)，均呈現(xiàn)出不規(guī)則的碎片狀，主要原因有2個(gè)，制備糊精時(shí)是先將淀粉在95℃高溫糊化，破壞了淀粉的完整結(jié)構(gòu);β-淀粉酶的水解作用，切斷了支鏈淀粉的側(cè)鏈部分，且不同的水解程度，切斷的程度也不相同，水解程度越大碎片越多。

圖2 蠟質(zhì)大米原淀粉及酶處理淀粉的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 Scanning electron micrographs of native and β-amylase treated starches

2.3 淀粉樣品的碘吸附曲線

碘液與淀粉顯色原理是碘分子可以鉆入支鏈淀粉螺旋空隙當(dāng)中，并借助范德華力與直鏈淀粉聯(lián)系在一起，從而形成絡(luò)合物。這種絡(luò)合物能比較均勻地吸收除藍(lán)光以外的其他可見(jiàn)光，從而使淀粉變?yōu)樯钏{(lán)色，并且最大峰出現(xiàn)的波長(zhǎng)越小，淀粉的鏈越短，所以淀粉-碘吸附曲線可以在一定程度上反映出淀粉的內(nèi)部鏈結(jié)構(gòu)［9］。

從圖3可以看出，與原淀粉相比，經(jīng)過(guò)酶解的樣品與碘的吸附能力(吸光度值)均有不同的降低，且最大吸收波長(zhǎng)向低值偏移。酶解樣品的吸附曲線變化基本一致，都在500～550 nm出現(xiàn)了最大吸收峰。原淀粉、β-1、β-3和β-7樣品的最大吸收波長(zhǎng)均向左偏移，β-15與β-20的最大吸收波長(zhǎng)接近，可能是水解到15 h時(shí)基本達(dá)到水解極限，繼續(xù)水解對(duì)樣品的影響不大。Xinyu［10］對(duì)β-淀粉酶水解的淀粉進(jìn)行碘吸附，得出淀粉鏈長(zhǎng)的縮短會(huì)減弱碘分子的吸附能力的結(jié)論，解釋了隨著水解時(shí)間的增加，淀粉樣品的吸光度值越低。王琳［11］等認(rèn)為最大波長(zhǎng)偏移與淀粉的平均鏈長(zhǎng)有關(guān)系，平均鏈長(zhǎng)越短，最大波長(zhǎng)向低值偏移。

圖3 淀粉-碘吸附結(jié)合物吸收曲線Fig.3 Wavelength scanning profiles of starch samples binding iodine

2.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖7顯示了GPC法測(cè)定不同水解程度的蠟質(zhì)大米糊精酶樣品的分子質(zhì)量分布，都表現(xiàn)為高低分子質(zhì)量峰的雙峰分布分別指定為峰1和峰2。酶解后的產(chǎn)物，峰1代表的大分子部分的含量逐漸減小，峰2代表的小分子部分的逐漸增多。蔡晶［12］用酸法水解玉米淀粉得出這樣的結(jié)論，隨著酸解時(shí)間的增加，高分子部分越少，低分子部分增加，分子質(zhì)量分布也逐漸變窄。

圖4 酶處理淀粉的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.4 Relative molecular mass distribution of β-amylase treated starches

酶解初始階段，酶與大量支鏈淀粉非還原尾端結(jié)合，作用點(diǎn)多，因此分子量降低的較快;隨著酶解時(shí)間的增加，當(dāng)作用位點(diǎn)接近淀粉支叉位置的α-1，6鍵時(shí)，酶解緩慢。由圖7所示，水解時(shí)間從1～20 h，分子質(zhì)量降低的速率變緩，最后酶解趨于穩(wěn)定，尤其是水解15 h和水解20 h時(shí)兩曲線趨于重合。

2.5 淀粉溶解度和膨脹度的測(cè)定

從圖5可以看出，隨著溫度的增加，蠟質(zhì)大米淀粉和不同水解程度的糊精溶解度逐漸增加;在同一個(gè)溫度下，隨著水解程度的增加，糊精的溶解度增加，糊精的溶解度明顯高于蠟質(zhì)大米原淀粉。淀粉顆粒由于具有雙螺旋結(jié)晶結(jié)構(gòu)，難以在冷水中分散溶解;在熱水中淀粉顆粒會(huì)發(fā)生膨脹和糊化，但由于淀粉分子量較大，在離心時(shí)容易發(fā)生沉淀，因此其溶解度較低［13］。而糊精是蠟質(zhì)大米淀粉糊化后經(jīng)淀粉酶降解的產(chǎn)物，糊化過(guò)程破壞了淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，加上淀粉酶的水解作用，淀粉分子質(zhì)量降低，所得的糊精具有高度的枝杈結(jié)構(gòu)，親水的能力加強(qiáng)，所以其溶解度較高。

圖5 原淀粉和酶處理淀粉的溶解度Fig.5 Solubility of native and β-amylase treated starches

圖6 原淀粉和酶處理淀粉的膨脹度Fig.6 Swelling power of native and β-amylase treated starches

由圖6可知隨著溫度的增加蠟質(zhì)大米淀粉和不同水解程度的糊精膨脹度有增高趨勢(shì);在同一個(gè)溫度下，糊精的膨脹度低于蠟質(zhì)大米原淀粉。隨溫度升高，淀粉顆粒膨脹變大吸收的水分逐漸增加直至完全破裂。糊精的顆粒結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞吸收水分能力相對(duì)降低。

2.6 透明度

透明度是淀粉糊化后所表現(xiàn)出的重要外在特征之一，對(duì)淀粉類產(chǎn)品的外觀及用途有直接的影響［14］。透明度的大小反映了淀粉顆粒在水中的溶脹、分散程度，分散程度越大越均勻，光線透過(guò)量就越大，透明度就越大;透明度的大小還可以反映出淀粉的凝沉性質(zhì)，淀粉的凝沉性越大，則淀粉在水中的分散程度就越低，透明度就越小。本實(shí)驗(yàn)制備的酶解淀粉與原淀粉分別分散于蒸餾水中的透明度測(cè)定結(jié)果，如圖7所示。

圖7 蠟質(zhì)大米原淀粉和酶處理淀粉的透明度Fig.7 The transparency of native and β-amylase treated starch

如圖7可知，酶處理后的淀粉樣品的透明度均高于原淀粉，蠟質(zhì)大米淀粉的透明度為14.7%，酶解后最大透明度為61.5%，且水解程度越大透明度越低。是因?yàn)樵矸鄯肿淤|(zhì)量大糊化后易凝沉分散程度低且不均勻，因此原淀粉的透明度最低;邵蘭蘭等［5］認(rèn)為原淀粉糊化后易回生形成凝膠束，光線照入糊液時(shí)有反射和散射現(xiàn)象產(chǎn)生，因此原淀粉的透明度低;制備的玉米極限精糊由于聚合度低，凝沉性弱，因此透明度高。本實(shí)驗(yàn)中水解程度越大的糊精透明度越低，可能是因?yàn)楹蠛肿影l(fā)生締合，糊精分子越小越容易發(fā)生締合阻礙光線穿過(guò)糊液，因此透明度隨著水解程度增大而降低。

3 結(jié)論

以蠟質(zhì)大米淀粉為原料，對(duì)不同酶解時(shí)間所得樣品的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行研究。當(dāng)β-淀粉酶加酶量為65 U/g，反應(yīng)時(shí)間為20 h時(shí)，水解率達(dá)到最大為56.7%;掃描電鏡結(jié)果顯示酶解后的樣品變成不規(guī)則碎片不再具有顆粒結(jié)構(gòu);隨著酶解程度的增大，淀粉-碘吸附物的最大吸收峰位置的偏移增大，直鏈淀粉含量降低均低于原淀粉;水解時(shí)間的增加，糊精的相對(duì)分子質(zhì)量逐漸減少;隨著溫度的升高，原淀粉的溶解度和膨脹度均增加，處理后的樣品溶解度高于原淀粉，膨脹度低于原淀粉，同一溫度下，隨著酶解率的增加溶解度逐漸增加。隨著酶解率的增加，樣品的透明度下降但遠(yuǎn)高于原淀粉的透明度。經(jīng)過(guò)β-淀粉酶處理的蠟質(zhì)大米淀粉在顆粒形貌、淀粉-碘吸附結(jié)合物最大吸收峰位置的變化、分子質(zhì)量變化、溶解度、膨脹度和透明度上都有其特殊的性質(zhì)，為糊精的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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