孫巖，郭慶興，童群義

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

2(百威英博(佛山)啤酒有限公司，廣東 佛山，528100)

油菜蜂花粉是工蜂從油菜花蕊內(nèi)采集的花粉粒，主要成分為蛋白質(zhì)、多糖、多酚、黃酮、必需氨基酸、維生素［1］等。因富含黃酮類化合物，常具有抗氧化、降血壓、降血脂、防治糖尿病和前列腺炎［2－9］等功效。黃酮類化合物種類繁多，目前從油菜蜂花粉中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有山奈酚、槲皮素、異鼠李素、楊梅黃酮、柚皮素等多種黃酮苷類和苷元。郭娟麗等［10］利用NMR、MS等方法鑒定出油菜蜂花粉含有山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，山奈酚-3，4'-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等9種單體。陳蓮君［11］利用NMR鑒定出油菜蜂花粉主要含有3種黃酮類，為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。而魯國(guó)慶［12］則從油菜蜂花粉殘?jiān)需b定出了山奈酚、異鼠李素、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。

目前常用的以固體原料來(lái)提取黃酮類傾合物的方法主要有熱回流法、超聲波法、微波法、超臨界CO2萃取法［13］。熱回流法成本低，操作簡(jiǎn)便易行，因此最為常用，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、提取效率低的弊端，此外，在提取過(guò)程中更多的非目標(biāo)成分被提取出來(lái)，使得后續(xù)的分離純化步驟難度增加［14］。超聲法和微波法提取效率相對(duì)較高，前者是利用空穴作用破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高有效成分溶出和擴(kuò)散，后者則是通過(guò)高能作用破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加有效成分溶出，利用微波電磁場(chǎng)加速擴(kuò)散，并且不同物質(zhì)的微波吸收能不同，可實(shí)現(xiàn)選擇性萃?。?5］。超聲-微波協(xié)同萃取法即是充分結(jié)合了超聲波及微波的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了低溫常壓環(huán)境下對(duì)固體樣品快速、高效、可靠的處理，成本相對(duì)超臨界CO2萃取也較低。

目前對(duì)上述常用方法的研究較多［16－18］，但用超聲-微波協(xié)同萃取油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)的研究少有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝，同時(shí)與上述幾種常用方法進(jìn)行了比較，并利用LC-MS對(duì)制得的黃酮類化合物種類進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜蜂花粉(烘干粉碎過(guò)100目篩，低溫保藏)，江蘇省慶緣康生物科技有限公司;蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%)，阿拉丁試劑有限公司;無(wú)水乙醇、石油醚(30℃～60℃)、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH，國(guó)藥試劑有限公司，分析純;甲醇、乙腈、甲酸，國(guó)藥試劑有限公司，色譜純。

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀(超聲波固定頻率40 kHz，功率50 W)，上海新拓分析儀器科技有限公司;UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;AB104-N電子天平，Mettler-ToledoInstr(ShangHai)Ltd;FA1004電子天平，上海天平儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;FW-80-I高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司;101－2－BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LC-Q-TOF)，美國(guó)Waters公司;Waters 600高效液相色譜儀，Waters公司(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g過(guò)篩后的油菜蜂花粉，用濾紙和脫脂棉線包成濾紙包，于索氏抽提器中抽提8 h，除去油脂和色素等雜質(zhì)，抽提完成后揮干石油醚，低溫儲(chǔ)藏，備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照中國(guó)藥典［16］描述的方法并加以改進(jìn)測(cè)定總黃酮含量。

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品30.00 mg，用無(wú)水乙醇溶解，超聲10 min使其完全溶解，然后轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶，用無(wú)水乙醇定容至刻度線，配制成0.300 0 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 0、1、2、3、4、5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入0～5號(hào)25 mL容量瓶中，并用蒸餾水補(bǔ)足體積到6 mL;加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%NaNO2，搖勻，靜置6 min;然后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min;再加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%NaOH，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min;于510 nm下測(cè)定吸光值。以蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=11.457 2x－0.002 3，R2=0.999 5。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測(cè)定

將樣品液稀釋到適宜濃度，然后取1 mL置于25 mL容量瓶，根據(jù)1.2.2測(cè)定方法，在510 nm下測(cè)定樣品吸光值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出樣品液濃度，然后計(jì)算總黃酮提取率(以蘆丁計(jì)，%)。

式中:c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的總黃酮濃度，mg/mL;V為提取液總體積，mL;K為提取液稀釋倍數(shù);m為原料質(zhì)量，g。

1.2.4 超聲微波協(xié)同萃取油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以油菜蜂花粉總黃酮提取率為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)、提取時(shí)間(s)、液料比(mL∶g)、微波功率(W)4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，以確定后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)各因素水平。

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)

準(zhǔn)確稱取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1進(jìn)行預(yù)處后，依照固定液料比20∶1，提取時(shí)間180 s，微波功率200 W不變，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%、100%的條件下進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取。

(2)提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1進(jìn)行預(yù)處后，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比20∶1，微波功率200 W 不變，分別在提取時(shí)間為 60、120、180、240、360、480 s的條件下進(jìn)行萃取。

(3)料液比(mL∶g)

準(zhǔn)確稱取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1進(jìn)行預(yù)處后，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時(shí)間240 s，微波功率200 W 不變，分別在液料比為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1的條件下進(jìn)行萃取。

(4)微波功率

準(zhǔn)確稱取2.0 g油菜蜂花粉，按1.2.1進(jìn)行預(yù)處后，依照固定乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取時(shí)間240 s，液料比 30∶1不變，分別在 50、100、200、300、400、500 W的條件下進(jìn)行萃取。

1.2.4.2 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步優(yōu)化油菜蜂花粉黃酮類物質(zhì)的提取工藝參數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.5 油菜蜂花粉黃酮類物質(zhì)的LC-MS分析

采用優(yōu)化的超聲-微波協(xié)同萃取最佳工藝進(jìn)行提取，抽濾提取液，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，濃縮液經(jīng)冷凍干燥制得黃酮粗提物，取適量，用色譜純甲醇溶解，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，制成澄清透明的液體，供LC-MS分析。

色譜條件:流速0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:0.3 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):200～400 nm;色譜柱:Waters Acquity UP-LC BEH Shield RP C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm);柱溫:45℃;樣品溫度20℃;流動(dòng)相:乙腈/0.1%甲酸，梯度洗脫:0～8 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)10%～60%;8～15 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)60%～100%。

質(zhì)譜條件:離子源:ESI電離源;電噴霧離子化負(fù)離子采集模式(ESI－);m/z范圍:50～1 000;毛細(xì)管電壓:3.0 kV;錐孔電壓:20.0 V;碰撞能量:4.0 eV，離子源溫度:100℃;脫溶劑溫度:400℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

如圖1所示，總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而提高。這是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)是弱極性化合物，易溶于弱極性溶劑。因此，綜合考慮選擇體積分?jǐn)?shù)90%～95%的乙醇作為后續(xù)提取溶劑。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect

2.1.2 時(shí)間對(duì)提取效果的影響

如圖2所示，在240 s以前總黃酮提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高，大于240 s后提取率基本不變，在360 s之后略有下降，可能是因?yàn)樽饔脮r(shí)間延長(zhǎng)使得提取液溫度較高，破壞了黃酮母核的結(jié)構(gòu)。為盡量降低高溫對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)的造成破壞的可能性，盡量選擇較的處理短時(shí)間。因此，實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間240 s。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.2 Influence of extraction times on extraction effect

2.1.3 液料比對(duì)提取效果的影響

如圖3所示，液料比從10∶1增加到30∶1的過(guò)程中，總黃酮提取率顯著提高，在料液比達(dá)到30∶1之后隨著溶劑用量的增加提取率變化平緩。這可能是由于液料比達(dá)到30∶1時(shí)，總黃酮幾乎已經(jīng)被萃取完全。另外，進(jìn)一步加大溶劑用量，會(huì)增加原料及后續(xù)濃縮工藝的成本，因此選用液料比30∶1較合理。

圖3 液料比對(duì)提取效果的影響Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on extraction effect

2.1.4 微波功率對(duì)提取效果的影響

如圖4所示，200 W以前總黃酮提取率隨微波功率增加而提高，200 W以后隨功率增加而下降。由于微波對(duì)花粉細(xì)胞壁的破碎作用隨著功率的增加而逐漸增強(qiáng)，從而有利于黃酮溶出，當(dāng)達(dá)到300 W左右后，提取液溫度較高，使得部分黃酮母核結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低提取率，因此實(shí)驗(yàn)中選取200 W。

圖4 微波功率對(duì)提取效果的影響Fig.4 Influence of microwave power on extraction effect

2.2 提取工藝優(yōu)化結(jié)果與討論

極差分析結(jié)果表明(見(jiàn)表2)，各因素對(duì)提取效果影響大小順序?yàn)锳＞C＞D＞B，正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取條件為A2C3D3B3。方差分析結(jié)果表明(見(jiàn)表3)，A、C和D因素的不同水平對(duì)總黃酮提取率有顯著差異，而B(niǎo)因素在所實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)沒(méi)有顯著差異。因此，綜合考慮節(jié)能，在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，油菜蜂花粉總黃酮最佳提取條件為A2C3D3B1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比30∶1，微波功率260 W，時(shí)間180 s。

最佳提取工藝確定:分析確定最佳提取工藝A2C3D3B1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比30∶1，微波功率260 W，時(shí)間180 s。

根據(jù)選擇的最佳提取條件A2C3D3B1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算總黃酮提取率，驗(yàn)證最佳實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，在該實(shí)驗(yàn)條件下，總黃酮提取率為3.36%，符合正交實(shí)驗(yàn)(表2)的結(jié)果，因此選擇的最佳提取工藝可行。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 不同提取方法比較

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所選最優(yōu)工藝及陳蓮君［11］、楊潔［20］、焦士蓉［21］等報(bào)道的熱回流、超聲法最優(yōu)提取工藝，確定不同提取方法比較的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比30∶1不變，其他參數(shù)如表4所示。結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同萃取總黃酮得率明顯高于超聲法和微波法，略高于熱回流法，但提取時(shí)間明顯短于熱回流法，在提取效率上具有明顯優(yōu)勢(shì)。可能是因?yàn)槌暡ǖ目栈饔?，加之微波的高能作用，共同促進(jìn)了乙醇的浸入，加速了黃酮在溶劑中的溶解和擴(kuò)散，大大減少了提取用時(shí)。

表4 不同提取方法的比較Table 4 Comparison of different extraction method

2.4 油菜蜂花粉黃酮類物質(zhì)的LC-MS分析

黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得其在HPLC條件下具有特征紫外光譜吸收帶，圖5為超聲微波協(xié)同萃取得到的油菜蜂花粉黃酮類物質(zhì)在350 nm下的液相色譜圖。

圖5 油菜蜂花粉黃酮液相色譜圖Fig.5 HPLC diagram of flavonoids extracted fromBrassica napus L.pollen

MS分析對(duì)液相色譜圖中出現(xiàn)的色譜峰分別進(jìn)行負(fù)離子的1、2級(jí)飛行時(shí)間質(zhì)譜研究，得到1、2級(jí)質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖6～圖9，其中a、b分別為1、2級(jí)質(zhì)譜圖。

化合物1:色譜峰1在4.02 min時(shí)的1級(jí)質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰［M-H］－625.068 2;2級(jí)質(zhì)譜給出［M-H］－丟失1個(gè)葡萄糖的碎片離子峰［(M-H)-162］－463.054 0，及［M-H］－丟失2個(gè)葡萄糖的槲皮素苷元的碎片離子峰［(M-2H)－162×2］－299.999 5。

化合物2:色譜峰4.12 min的1級(jí)質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰［M-H］－609.065 2，2級(jí)質(zhì)譜給出［M-H］－丟失1個(gè)葡萄糖的碎片離子峰［(M-H)－162］－447.056 7，及［M-H］－丟失2個(gè)葡萄糖的山奈酚苷元的碎片離子峰［(M-H)－162×2］－285.019 8。

化合物3:色譜峰4.50 min的1級(jí)質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰［M-H］－639.088 5，2級(jí)質(zhì)譜給出［M-H］－丟失2個(gè)葡萄糖的碎片離子峰［(M-2H)－162×2］－314.023 3，可能是異鼠李素苷元的碎片離子峰。

化合物4:色譜峰4.68 min的1級(jí)質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰［M-H］－609.065 2，2級(jí)質(zhì)譜給出［M-H］－丟失2個(gè)葡萄糖的碎片離子峰［(M-2H)－162×2］－284.013 6，可能是山奈酚苷元的碎片離子峰。

根據(jù)阿布拉江·克依木［22］對(duì)黃酮醇O-雙糖苷類化合物、黃酮醇二-O糖苷類化合物質(zhì)譜行為的詳細(xì)報(bào)道和郭娟麗［10］對(duì)油菜花粉中醇提組分的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜圖所對(duì)應(yīng)的離子峰的質(zhì)譜信息，推斷HPLC分離出的4個(gè)主要峰所對(duì)應(yīng)的化合物依次為:槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3，4'-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

圖6 化合物1的質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)式Fig.6 The mass spectrum andstructural formula of compound 1

圖7 化合物2的質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)式Fig.7 The mass spectrum and structural formula of compound 2

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定超聲-微波協(xié)同萃取油菜蜂花粉中總黃酮類物質(zhì)最佳條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比(mL∶g)30∶1，微波功率 260 W，時(shí)間180 s。該條件下，油菜蜂花粉中總黃酮提取率為3.36%。

不同提取方式的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同萃取法提取效率較熱回流法、超聲法和微波法明顯提高，并且降低了高溫高壓條件導(dǎo)致的萃取物生物活性被破壞的可能。因此，超聲-微波協(xié)同萃取是一種較為理想的提取方法，具有高效、節(jié)能，安全的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)油菜蜂花粉黃酮類物質(zhì)的提取具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖9 化合物4的質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)式Fig.9 The mass spectrum andstructural formula of compound 4

超聲-微波協(xié)同萃取得到的油菜蜂花粉黃酮類物質(zhì)經(jīng)LC-MS鑒定主要為4種。以液相色譜圖和質(zhì)譜圖為依據(jù)，參考文獻(xiàn)報(bào)道分析，推斷出這4種化合物可能為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3，4'-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)信息，還需要進(jìn)一步分析和鑒定。

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