張明燈

[摘要] 目的 探討白藜蘆醇對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠核因子NF-κB的抑制作用，從而闡明白藜蘆醇的抗炎作用機(jī)制。 方法 用丙烯醛霧化吸入構(gòu)建COPD大鼠模型。不同濃度的白藜蘆醇（5、15、45 mg/kg）預(yù)處理COPD大鼠模型，逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠模型肺組織核因子NF-κB的抑制作用。 結(jié)果 不同濃度的白藜蘆醇顯著抑制COPD大鼠模型肺組織炎癥因子NF-κB的水平。 結(jié)論 白藜蘆醇通過抑制炎癥因子NF-κB的水平從而對(duì)COPD模型大鼠肺組織發(fā)揮抗炎作用。

[關(guān)鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病；白藜蘆醇；核因子-κB；抗炎

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）10（b）-0014-03

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道炎癥可引起氣管黏膜充血水腫、黏液分泌增多、氣管平滑肌痙攣，最終導(dǎo)致氣流受限及肺結(jié)構(gòu)破壞[1]，抑制炎癥反應(yīng)成為治療COPD的重要靶點(diǎn)。植物多酚白藜蘆醇（resveratrol，Res）具有顯著的抗氧化、抗炎和抗衰老等生物學(xué)效應(yīng)，在COPD、支氣管哮喘、肺纖維化等肺部炎癥性疾病中具有抗炎保護(hù)作用[2]。霧化吸入丙烯醛可以誘導(dǎo)產(chǎn)生COPD SD大鼠模型[3]，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠模型肺組織炎性炎癥因子NF-κB的mRNA表達(dá)的抑制作用，探討白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠模型肺組織是否具有抗炎機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要儀器和試劑：Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、PCR儀（Bio-Rad公司）、電泳儀（北京賽因坦科技有限公司）；白藜蘆醇（批號(hào)：R4080）、NF-κB的基因引物（上海生物工程公司合成）；丙烯醛（購自美國Sigma公司，批號(hào)A2635）；Trizol RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的50只SD雄性大鼠（SPF級(jí)），體重為（400±25）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模 SD雄性大鼠50只（SPF級(jí)），按照隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組10只，分別為對(duì)照組、COPD模型組、白藜蘆醇低劑量預(yù)防組、白藜蘆醇中劑量預(yù)防組、白藜蘆醇高劑量預(yù)防組。使用規(guī)格為35 cm×40 cm×50 cm的動(dòng)物熏吸箱（課題組自制），將各組大鼠分別放入其中，然后采用蒸餾水分別對(duì)模型組、對(duì)照組大鼠灌胃，1 h后對(duì)模型組進(jìn)行丙烯醛（6.87 μg/L）霧化吸入，而對(duì)照組采用蒸餾水霧化吸入。預(yù)防組分別用低、中、高劑量白藜蘆醇灌胃，給藥1 h后，分別進(jìn)行丙烯醛霧化吸入，5 mg/（kg·d）、15 mg/（kg·d）、45 mg/（kg·d）分別標(biāo)記為低、中、高劑量。上下午2次霧化吸入，每次持續(xù)2 h， 間隔5 h，5 d/周，共120 d。

1.2.2 大鼠肺組織中炎癥因子NF-κB表達(dá)量的變化 水合氯醛麻醉大鼠后取出肺組織，按照TRNzol RNA提取試劑盒步驟進(jìn)行總RNA的提取、cDNA的合成、目的片段的擴(kuò)增（PCR法）。反應(yīng)條件：NF-κB預(yù)變性15 min（95℃），變性15 s（95℃），退火25 s（60℃），延伸20 s，循環(huán)45次。GAPDH：預(yù)變性15min（95℃），變性15 s（95℃），退火25 s（60℃），延伸20 s（72℃），45次循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖膠電泳45 min，凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像，Quantity one4.4.0計(jì)算各條帶的熒光強(qiáng)度值及其與GAPDH的比值、引物序列及其產(chǎn)物長度（表 1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組、白藜蘆醇預(yù)防組NF-κB的mRNA水平與對(duì)照組比較均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；白藜蘆醇低、中和高劑量預(yù)防組NF-κB的mRNA水平與模型組比較均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05） （圖1、圖2、表2）。

圖1 PCR檢測(cè)不同劑量白藜蘆醇抑制丙烯醛誘導(dǎo)肺組織中

NF-κB的表達(dá)

圖2 不同劑量的白藜蘆醇抑制丙烯醛誘導(dǎo)肺組織中NF-κB的

表達(dá)水平

與模型組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05

表2 不同劑量的白藜蘆醇抑制丙烯醛誘導(dǎo)肺組織中NF-κB的

表達(dá)水平（pg/ml，x±s）

與模型組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

炎癥反應(yīng)導(dǎo)致小氣道纖維化和肺泡破壞，這是COPD發(fā)病的核心因素。參與COPD炎癥反應(yīng)的炎癥因子較為復(fù)雜，其中NF-κB調(diào)節(jié)包括細(xì)胞因子、黏附分子、急性期蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子等大量基因和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，是促炎癥基因表達(dá)的重要樞紐。NF-κB活化后可促進(jìn)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，因此阻止NF-κB活化成為減輕COPD炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵所在。

白藜蘆醇為多酚類植物抗毒素，存在于花生、松樹、葡萄、桑葚等植物體中，自然界分布廣泛，具有抗炎[4]、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤[5]、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)等作用。白藜蘆醇能夠在COPD、支氣管哮喘、肺纖維化和肺動(dòng)脈高壓等肺部炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用[6]。

本研究中，COPD模型組、白藜蘆醇預(yù)防組肺組織NF-κB的mRNA水平均增高，而采用不同劑量白藜蘆醇干預(yù)后，大鼠肺組織NF-κB的mRNA表達(dá)下降，提示白藜蘆醇能夠發(fā)揮抗炎效應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，白藜蘆醇可以抑制體內(nèi)促炎癥基因表達(dá)的樞紐——NF-κB的激活[7]，下調(diào)iNOS、TNF-α等炎性因子的基因表達(dá)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)。有研究提示白藜蘆醇能夠負(fù)調(diào)控核因子-κB，減輕COPD炎癥細(xì)胞活化和IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落因子等炎癥因子的釋放[8]。抑制NF-κB活性成為控制COPD炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。

NF-κB參與調(diào)節(jié)急性期蛋白、黏附分子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)因子等免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)，同時(shí)活化后的NF-κB能夠增強(qiáng)炎性蛋白的表達(dá)。NF-κB的活化與COPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，近年來的研究證實(shí)COPD是一種全身炎癥性疾病，因此抗炎治療在COPD的治療中有著舉足輕重的地位。

大量研究報(bào)道了白藜蘆醇抗炎作用的分子機(jī)制，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB活化減輕糖尿病大鼠血管炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞聚集[9]；白藜蘆醇通過NF-κB途徑阻滯兔關(guān)節(jié)軟骨凋亡[10]，提示白藜蘆醇能夠下調(diào)NF-κB的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相符合，白藜蘆醇抑制NF-κB的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NF-κB是調(diào)節(jié)COPD炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵樞紐，而白藜蘆醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-κB基因的表達(dá)，封閉炎癥反應(yīng)過程。進(jìn)一步探討白藜蘆醇干預(yù)炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制，可為防止COPD提供新思路。隨著白藜蘆醇生理、藥理活性的深入研究，其有望成為防治COPD的新型藥物，將減輕COPD給患者帶來的沉重負(fù)擔(dān)[11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Vestbo J，Hurd SS，Agustí AG，et al.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease：GOLD executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，187（4）：347-365.

[2] Lee M，Kim S，Kwon，OK，et al.Anti-inflammatory and antiasthmatic effects of resveratrol，a polyphenolic stilbene，in a mouse model of allergic asthma[J].Int Immunopharmacol，2009，9（4）：418-424.

[3] Moretto N，Volpi G，Pastore F，et al.Acrolein effects in pulmonary cells：relevance to chronic obstructive pulmonary disease[J].Ann N Y Acad Sci，2012，（1259）：39-46.

[4] Chalal M，Klinguer A，Echairi A，et al.Antimicrobial activity of resveratrol analogues[J]. Molecules，2014，19（6）：7679-7688.

[5] Carter LG，D'Orazio JA，Pearson KJ.Resveratrol and cancer：focus on in vivo evidence[J]. Endocr Relat Cancer，2014，21（3）：R209-R225.

[6] Knobloch J，Hag H，Jungck D，et al.Resveratrola impairs the release of steroid-resistant cytokines from bacterial endotoxin-exposed alveolargic asthma[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，109（2）：138-143.

[7] Siedlinski M，Boer JM，Smit HA，et al.Dietary factors and lung function in the general population：wine and resveratrol intake[J].Eur Respir J，2012，39（2）：385-391.

[8] Knobloch J，Sibbling B，Jungck D，et al.Resveratrol impairs the of steroid-resistant inflammatory cytokines from human airway smooth muscle cells in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Pharmacol Exp Ther，2010，335（3）：788-798.

[9] Guo R，Liu B，Wang K，et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diab Vasc Dis Res. 2014，11（2）：92-102.

[10] Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther（Seoul），2013，21（5）：364-370.

[11] Slok AH，In T Veen JC，Chavannes NH，et al.Effectiveness of the assessment of burden of chronic obstructive pulmonary disease（ABC）tool：study protocol of a cluster randomised trial in primary and secondary care[J].BMC Pulm Med，2014，（14）：131.

（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：祁海文）

NF-κB參與調(diào)節(jié)急性期蛋白、黏附分子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)因子等免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)，同時(shí)活化后的NF-κB能夠增強(qiáng)炎性蛋白的表達(dá)。NF-κB的活化與COPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，近年來的研究證實(shí)COPD是一種全身炎癥性疾病，因此抗炎治療在COPD的治療中有著舉足輕重的地位。

大量研究報(bào)道了白藜蘆醇抗炎作用的分子機(jī)制，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB活化減輕糖尿病大鼠血管炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞聚集[9]；白藜蘆醇通過NF-κB途徑阻滯兔關(guān)節(jié)軟骨凋亡[10]，提示白藜蘆醇能夠下調(diào)NF-κB的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相符合，白藜蘆醇抑制NF-κB的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NF-κB是調(diào)節(jié)COPD炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵樞紐，而白藜蘆醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-κB基因的表達(dá)，封閉炎癥反應(yīng)過程。進(jìn)一步探討白藜蘆醇干預(yù)炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制，可為防止COPD提供新思路。隨著白藜蘆醇生理、藥理活性的深入研究，其有望成為防治COPD的新型藥物，將減輕COPD給患者帶來的沉重負(fù)擔(dān)[11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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[7] Siedlinski M，Boer JM，Smit HA，et al.Dietary factors and lung function in the general population：wine and resveratrol intake[J].Eur Respir J，2012，39（2）：385-391.

[8] Knobloch J，Sibbling B，Jungck D，et al.Resveratrol impairs the of steroid-resistant inflammatory cytokines from human airway smooth muscle cells in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Pharmacol Exp Ther，2010，335（3）：788-798.

[9] Guo R，Liu B，Wang K，et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diab Vasc Dis Res. 2014，11（2）：92-102.

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[11] Slok AH，In T Veen JC，Chavannes NH，et al.Effectiveness of the assessment of burden of chronic obstructive pulmonary disease（ABC）tool：study protocol of a cluster randomised trial in primary and secondary care[J].BMC Pulm Med，2014，（14）：131.

（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：祁海文）

NF-κB參與調(diào)節(jié)急性期蛋白、黏附分子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)因子等免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)，同時(shí)活化后的NF-κB能夠增強(qiáng)炎性蛋白的表達(dá)。NF-κB的活化與COPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，近年來的研究證實(shí)COPD是一種全身炎癥性疾病，因此抗炎治療在COPD的治療中有著舉足輕重的地位。

大量研究報(bào)道了白藜蘆醇抗炎作用的分子機(jī)制，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB活化減輕糖尿病大鼠血管炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞聚集[9]；白藜蘆醇通過NF-κB途徑阻滯兔關(guān)節(jié)軟骨凋亡[10]，提示白藜蘆醇能夠下調(diào)NF-κB的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相符合，白藜蘆醇抑制NF-κB的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NF-κB是調(diào)節(jié)COPD炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵樞紐，而白藜蘆醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-κB基因的表達(dá)，封閉炎癥反應(yīng)過程。進(jìn)一步探討白藜蘆醇干預(yù)炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制，可為防止COPD提供新思路。隨著白藜蘆醇生理、藥理活性的深入研究，其有望成為防治COPD的新型藥物，將減輕COPD給患者帶來的沉重負(fù)擔(dān)[11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

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[2] Lee M，Kim S，Kwon，OK，et al.Anti-inflammatory and antiasthmatic effects of resveratrol，a polyphenolic stilbene，in a mouse model of allergic asthma[J].Int Immunopharmacol，2009，9（4）：418-424.

[3] Moretto N，Volpi G，Pastore F，et al.Acrolein effects in pulmonary cells：relevance to chronic obstructive pulmonary disease[J].Ann N Y Acad Sci，2012，（1259）：39-46.

[4] Chalal M，Klinguer A，Echairi A，et al.Antimicrobial activity of resveratrol analogues[J]. Molecules，2014，19（6）：7679-7688.

[5] Carter LG，D'Orazio JA，Pearson KJ.Resveratrol and cancer：focus on in vivo evidence[J]. Endocr Relat Cancer，2014，21（3）：R209-R225.

[6] Knobloch J，Hag H，Jungck D，et al.Resveratrola impairs the release of steroid-resistant cytokines from bacterial endotoxin-exposed alveolargic asthma[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，109（2）：138-143.

[7] Siedlinski M，Boer JM，Smit HA，et al.Dietary factors and lung function in the general population：wine and resveratrol intake[J].Eur Respir J，2012，39（2）：385-391.

[8] Knobloch J，Sibbling B，Jungck D，et al.Resveratrol impairs the of steroid-resistant inflammatory cytokines from human airway smooth muscle cells in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Pharmacol Exp Ther，2010，335（3）：788-798.

[9] Guo R，Liu B，Wang K，et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diab Vasc Dis Res. 2014，11（2）：92-102.

[10] Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther（Seoul），2013，21（5）：364-370.

[11] Slok AH，In T Veen JC，Chavannes NH，et al.Effectiveness of the assessment of burden of chronic obstructive pulmonary disease（ABC）tool：study protocol of a cluster randomised trial in primary and secondary care[J].BMC Pulm Med，2014，（14）：131.

（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：祁海文）