鄧偉坤++++李艷卿++++李敏研++++施靜雯

[摘要] 目的 觀察中藥復(fù)骨方對(duì)糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松骨折模型大鼠骨代謝及骨密度的影響。 方法 將48只SD大鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、模型組及治療組各16只?；A(chǔ)組僅給予肌內(nèi)注射生理鹽水1 mg/kg，模型組和治療組予肌內(nèi)注射地塞米松1 mg/kg，1次/d，3次/周，用藥8周建立糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（GIOP）模型。第8周末對(duì)3組大鼠手術(shù)造成單側(cè)股骨閉合性骨折，骨折處采用金屬內(nèi)固定，復(fù)制GIOP骨折模型。術(shù)后第2天開始治療組中藥復(fù)骨方藥液灌胃，持續(xù)8周。檢測(cè)大鼠血清鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（BGP）指標(biāo)，采用雙能X線吸收法（DXA）測(cè)量大鼠股骨骨密度。 結(jié)果 骨折術(shù)前，模型組大鼠骨密度值為（0.219±0.013） g/cm2，基礎(chǔ)組骨密度值為（0.283±0.015） g/cm2，模型組骨密度值明顯低于基礎(chǔ)組（t=12.8970，P<0.05）。實(shí)驗(yàn)16周末，治療組股骨全長骨骨密度為（0.265±0.014） g/cm2，高于模型組（t=9.8403，P<0.05）。實(shí)驗(yàn)12周末，治療組大鼠血清Ca為（2.35±0.19） mmol/L、P為（2.47±0.23） mmol/L、ALP為（196.74±25.38） U/L及BGP為（1.33±0.25） μg/L，與模型組比較均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 中藥復(fù)骨方可顯著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高GIOP骨折大鼠血清Ca、P、ALP及BGP活性，促進(jìn)骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)骨方；骨代謝；骨密度；糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松；骨折；大鼠

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）10（b）-0008-04

骨質(zhì)疏松是骨代謝障礙的一種全身性骨骼疾病，骨骼是動(dòng)態(tài)變化的組織，骨轉(zhuǎn)換過程是破骨細(xì)胞吸收舊骨、成骨細(xì)胞形成類骨質(zhì)并進(jìn)行礦化新骨的過程，當(dāng)骨吸收大于骨形成就導(dǎo)致了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是一種因內(nèi)源或外源糖皮質(zhì)激素所致的，以骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為特征的代謝性骨病[1]，其發(fā)病率位居繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥首位[2]。骨轉(zhuǎn)換過程可以通過生化標(biāo)志反映出來，間接顯示成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的活性，與骨形成有關(guān)的代謝指標(biāo)有堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（BGP）等。本實(shí)驗(yàn)擬以肌內(nèi)注射地塞米松致大鼠GIOP，并建立GIOP大鼠股骨閉合骨折模型，觀察中藥復(fù)骨方對(duì)模型大鼠骨代謝及骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取3個(gè)月齡雌性SD大鼠48只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（280±20） g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。實(shí)驗(yàn)過程中，所有動(dòng)物在同等清潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度為（24±1）℃，濕度為50%～70%，每天光照與黑暗時(shí)間各12 h，喂飼全價(jià)營養(yǎng)鼠飼料（購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：NO.11002900006734），自由進(jìn)水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 實(shí)驗(yàn)中藥復(fù)骨方由骨碎補(bǔ)、杜仲、續(xù)斷、千年健、紅花、歸尾、川芎等組成，藥材購自廣州大參林藥房，由廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院藥劑科藥房加工，藥物煎煮后濃縮到含生藥0.5 g/ml，4℃保存。地塞米松磷酸鈉注射液（天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號(hào)H41021255，批號(hào)0807031，規(guī)格：1 ml∶5 mg）；生理鹽水（廣東科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號(hào)H20045198，批號(hào)D12070311-2，規(guī)格：500 ml∶4.5 g）；青霉素（廣州白云山天心制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號(hào)H20013260）；麻醉劑3.5%水合氯醛（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110514）。

1.1.3 試劑儀器 血清鈣（Ca）、磷（P）、ALP試劑盒（批號(hào)：20130708、20131016、2130915，由南京建成生物技術(shù)公司提供）；血清BGP放免試劑盒（購自北京原子高科股份有限公司，批號(hào)：201311）。實(shí)驗(yàn)儀器：日立7600全自動(dòng)生化儀；離心機(jī)（型號(hào)：TDZ5-WS，長沙平凡儀器有限公司）；XH6080型放免儀（西安核儀廠）；雙能X線儀DEXA（LUNAR-DPXIQ型，美國GE Lunar公司）；骨折造模支架參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]自制。

1.2 方法

1.2.1 建模方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、模型組及治療組各16只。每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量?；A(chǔ)組：肌內(nèi)注射生理鹽水1 ml/（kg·d），3次/周，8周后手術(shù)造成大鼠右側(cè)股骨骨折，骨折處采用金屬內(nèi)固定，術(shù)后3 d常規(guī)抗感染處理，每日肌內(nèi)注射1 000 000 U青霉素。術(shù)后第2天開始給予蒸餾水10 ml/kg灌胃，1次/d，持續(xù)8周。模型組：肌內(nèi)注射地塞米松1 mg/（kg·d），3次/周，持續(xù)8周，復(fù)制GIOP模型。8周末手術(shù)造成GIOP大鼠右側(cè)股骨骨折，骨折處采用金屬內(nèi)固定，術(shù)后常規(guī)抗感染處理同基礎(chǔ)組，術(shù)后第2天開始給予蒸餾水10 ml/kg 灌胃，1次/d，持續(xù)8周。治療組：前8周GIOP骨折造模及骨折術(shù)后抗感染處理同模型組。骨折術(shù)后第2天以復(fù)骨方藥液10 ml/kg灌胃給藥，1次/d，持續(xù)8周。

1.2.2 骨折手術(shù)方法 應(yīng)用3.5%水合氯醛（10 ml/kg）對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，縱行切開右下肢髕骨內(nèi)側(cè)皮膚（長0.6～0.8 cm）及部分股四頭肌腱性組織，將髕骨牽向外側(cè)使之脫位，暴露股骨髁間凹。用20號(hào)注射針自股骨髁間凹插入髓腔擴(kuò)髓，然后取出，再逆行插入直徑1 mm克氏針，從大轉(zhuǎn)子及皮膚穿出，將內(nèi)固定針遠(yuǎn)端埋于股骨髁間骨皮質(zhì)下，近端緊貼大轉(zhuǎn)子將尾部折彎，多余部分剪除后閉合切口。將動(dòng)物右下肢外展內(nèi)旋位固定于造模支架的鐵砧凹槽上（鐵砧凹槽間距為15 mm），造模支架中柱下端的骨刀壓于大鼠股骨中部，助手提起500 g的砝碼，從至20 cm高處將砝碼自由落體撞向刀背，造成實(shí)驗(yàn)大鼠股骨中段閉合性骨折[3]。

1.2.3 血樣本采集及血生化指標(biāo)檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)8周末骨折手術(shù)前1天及實(shí)驗(yàn)12周末對(duì)3組動(dòng)物采血。方法：以3.5%的水合氯醛溶液10 ml/kg腹腔注射麻醉，由腹主動(dòng)脈取血，血樣靜置后2500 r/min離心20 min，分離出血清，置-40℃保存，按照試劑盒說明應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)Ca、P和ALP含量，BGP活性采用放射免疫法檢測(cè)。

1.2.4 骨密度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)8周末對(duì)基礎(chǔ)組和模型組的大鼠腹腔注射麻醉劑，采用雙能X線吸收法（DEXA）以LUNAR-DPXIQ型骨密度儀及所附帶的小動(dòng)物軟件測(cè)量大鼠活體全身骨密度，驗(yàn)證骨質(zhì)疏松模型的建立是否成功。16周末注射麻醉劑，處死大鼠，在無菌條件下取雙側(cè)股骨，剔除附著組織，拔除克氏針，4℃避光保存在70%乙醇中，應(yīng)用DEXA分別測(cè)量右側(cè)股骨全長骨密度及骨痂骨密度（骨痂中點(diǎn)上下10 mm處骨密度）。骨密度采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量表示（g/cm2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SSPS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠骨密度的變化

實(shí)驗(yàn)8周末骨折術(shù)前，模型組大鼠骨密度值為（0.219±0.013） g/cm2，基礎(chǔ)組骨密度值為（0.283±0.015） g/cm2，模型組骨密度值明顯低于基礎(chǔ)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.8970，P<0.05），說明GIOP模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)16周末，治療組股骨全長骨和骨痂骨密度均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組全長骨和骨痂骨密度均低于基礎(chǔ)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)16周末3組大鼠股骨骨密度值的比較（g/cm2，x±s）

與基礎(chǔ)組比較，t=11.2532，*P<0.05；t=13.7601，#P<0.05；與模型組比較，t=9.8403，△P<0.05；t=9.4618，▲P<0.05

2.2 實(shí)驗(yàn)中大鼠血清生化指標(biāo)的改變

實(shí)驗(yàn)8周末，GIOP造模期，模型組、治療組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性與基礎(chǔ)組比較均顯著降低（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)12周末，治療組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性與模型組比較均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性顯著低于基礎(chǔ)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 實(shí)驗(yàn)中3組大鼠血清生化指標(biāo)的比較（x±s）

與基礎(chǔ)組對(duì)應(yīng)時(shí)間比較，*P<0.05；與基礎(chǔ)組8周末比較，#P<0.05；與模型組12周末比較，△P<0.05

3 討論

糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松癥是最常見的藥源性骨質(zhì)疏松[4]。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）將骨質(zhì)疏松定義為一種以骨強(qiáng)度受損、骨折危險(xiǎn)增加的骨骼疾病[5]，而骨強(qiáng)度是骨密度和骨質(zhì)量的綜合反映。骨密度即單位骨面積所含的骨礦物量，是反映骨強(qiáng)度與骨量的主要指標(biāo)，是目前用于骨質(zhì)疏松診斷、骨折危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠肌內(nèi)注射地塞米松8周后，模型組大鼠骨密度顯著降低，血清生化檢查提示模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性與基礎(chǔ)組比較均顯著降低，模型組骨代謝呈現(xiàn)一種低骨形成和高骨吸收的狀態(tài)，說明大鼠骨質(zhì)疏松模型復(fù)制成功，與國內(nèi)相關(guān)研究建模方法一致[7-9]。實(shí)驗(yàn)16周末，治療組股骨全長骨和骨痂骨密度均高于模型組，說明復(fù)骨方治療可有效提高模型大鼠的骨密度，促進(jìn)骨折的愈合。

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的生物學(xué)修復(fù)過程，受諸多因素的影響。血清ALP是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，是骨形成所必需的酶。ALP能分解有機(jī)磷酸化合物，促使無機(jī)磷酸鹽離子與鈣離子結(jié)合成磷酸鈣而沉淀于骨組織內(nèi)，成骨細(xì)胞分泌的ALP可以滲入血液，使血液ALP含量增加，ALP的活性常可提示骨折局部細(xì)胞增殖和活躍的程度，因此血清ALP可作為骨重建活躍性改變的標(biāo)志，是一項(xiàng)觀察骨折愈合的指標(biāo)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)GIOP造模期，模型組大鼠血清ALP與基礎(chǔ)組比較顯著降低，說明糖皮質(zhì)激素可使大鼠血清中ALP活性顯著下降，從而抑制成骨細(xì)胞的作用，并加強(qiáng)骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。在人為骨折4周后，為骨重建期和骨塑形期。本實(shí)驗(yàn)選擇骨折術(shù)后經(jīng)采用復(fù)骨方中藥治療4周時(shí)采血測(cè)定血清生化指標(biāo)，以觀察中藥對(duì)骨折骨重建期骨代謝的影響，結(jié)果顯示治療組大鼠血清ALP活性明顯高于模型組，由此可以推測(cè)，復(fù)骨方能提高骨折愈合重建時(shí)血清ALP的活性，增強(qiáng)骨折部位成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨折愈合。復(fù)骨方由骨碎補(bǔ)、杜仲、續(xù)斷、千年健、紅花、歸尾、川芎等組成，研究發(fā)現(xiàn)[12]，骨碎補(bǔ)可能通過提高血鈣、磷的濃度，促進(jìn)鈣、磷沉積，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)成骨細(xì)胞增殖活動(dòng)，提高血清ALP的活性從而促進(jìn)骨折愈合。

正常的骨代謝過程是通過消化道的吸收和排泌、腎臟的濾過和重吸收、骨骼的礦化和再吸收三方面的調(diào)節(jié)。鈣鹽在骨中沉積和骨中鈣鹽溶解的正常進(jìn)行是維持血液中鈣磷含量穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)，血液中鈣磷含量的高低又直接影響骨的鈣化和溶解。糖皮質(zhì)激素能夠降低腸鈣吸收，并抑制腎鈣的再吸收，影響骨的礦化。趙亮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷可提高骨折愈合中血清ALP的活性，升高鈣磷沉積，促進(jìn)骨形成。杜仲含有豐富膠原、磷、鈣鹽等微量元素，能激活骨折愈合過程中相關(guān)細(xì)胞釋放更多的ALP，提高血清ALP的活性，有利于骨質(zhì)修復(fù)[14]。具有補(bǔ)腎壯骨功效的中藥復(fù)骨方能提高模型大鼠血鈣水平，有助于新骨的形成或鈣化，并促進(jìn)骨重建和骨折愈合。

BGP來源于骨組織，由成骨細(xì)胞合成并分泌到骨中，是骨組織中非膠原性蛋白的主要成分，約占骨質(zhì)蛋白的3%，其作用是調(diào)節(jié)和維持骨鈣[15]。部分BGP沉積于骨基質(zhì)，部分進(jìn)入血液循環(huán)，因此，血清中BGP濃度可特異性地反映成骨細(xì)胞的活性[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)8周末，模型組大鼠血清中BGP的含量比基礎(chǔ)組顯著降低，說明長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素造成大鼠成骨細(xì)胞的活性顯著降低，抑制骨形成。骨折術(shù)后，經(jīng)過4周治療，治療組大鼠血清中BGP的含量接近基礎(chǔ)組，明顯高于模型組，提示中藥復(fù)骨方可以使成骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌BGP，促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，中藥復(fù)骨方灌胃治療可顯著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中藥復(fù)骨方通過升高血Ca、P促進(jìn)新骨的形成或鈣化，提高骨折愈合重建時(shí)血清ALP的活性，增強(qiáng)骨折部位成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌BGP，提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促進(jìn)骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：郭靜娟）

綜上所述，中藥復(fù)骨方灌胃治療可顯著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中藥復(fù)骨方通過升高血Ca、P促進(jìn)新骨的形成或鈣化，提高骨折愈合重建時(shí)血清ALP的活性，增強(qiáng)骨折部位成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌BGP，提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促進(jìn)骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：郭靜娟）

綜上所述，中藥復(fù)骨方灌胃治療可顯著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中藥復(fù)骨方通過升高血Ca、P促進(jìn)新骨的形成或鈣化，提高骨折愈合重建時(shí)血清ALP的活性，增強(qiáng)骨折部位成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌BGP，提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促進(jìn)骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：郭靜娟）