紀亮 張鵬 沈雷

[摘要] 目的 闡明錳超氧化物歧化酶（MnSOD）轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞（MSC）對糖尿病足（DF）的治療作用和機制，為干細胞技術(shù)治療疾病奠定研究基礎(chǔ)。方法 鏈脲佐菌素法建立C57BL/6J小鼠糖尿病足模型，分別以2×104 MSC的實驗組（pcDNA3.1-MnSOD轉(zhuǎn)染MSC）、空白質(zhì)粒組（僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1）和對照組（未轉(zhuǎn)染者為MSC）進行局部注射治療，在7、14 d觀察傷口愈合情況，并分別切取皮膚組織，進行CD34免疫組化染色，觀察血管密度變化，ELISA法檢測各組觀察點的勻漿皮膚組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽氧化還原酶（GSHPX）變化。 結(jié)果 與空白質(zhì)粒組相比，MnSOD-MSC實驗組傷口愈合明顯加快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；MnSOD-MSC實驗組血管密度比空白質(zhì)粒組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MnSOD-MSC實驗組GSHPX、SOD含量明顯比空白質(zhì)粒組表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）1。結(jié)論 MnSOD轉(zhuǎn)染MSC可以促進抗氧化酶類表達增高，促進血管內(nèi)皮細胞抗自由基損傷，加速血管新生和糖尿病足愈合。

[關(guān)鍵詞] 錳超氧化物歧化酶；間充質(zhì)干細胞；自由基；糖尿病足；血管

[中圖分類號] R730.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）05（b）-0017-03

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）預(yù)測，2035年全球糖尿病患者將增加到5.92億[1]。活性氧增加是糖尿病高血糖損傷臟器的原因之一[2]，活性氧積累會使細胞損傷和傷口新生血管障礙，直接導(dǎo)致肢體皮膚缺血潰瘍，發(fā)生在下肢的缺血性潰瘍?yōu)樘悄虿∽悖―F），該病發(fā)病率為13.5%～16.7%，致殘率為1‰～2.1‰，嚴重危及患者生命[3]，目前移植MSC到糖尿病傷口，可以通過促血管新生、毛囊再生等途徑促使傷口愈合[4]，但是MSC自身也受到高血糖的影響，如何在高血糖條件下，促進MSC抗自由基作用，發(fā)揮MSC的治療效果，是值得探討的重要課題，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽氧化還原酶（GSHPX）等物質(zhì)，錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和鐵超氧化物歧化酶（FeSOD）等是重要的SOD家族成員，MnSOD在SOD家族中發(fā)揮重要作用，但是高糖條件下通過MnSOD逆轉(zhuǎn)自由基損害，發(fā)揮對MSC的保護作用研究較少[5]。該研究于2012年9月—2013年2月進行試驗研究，闡明MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，探索MnSOD-MSC促進糖尿病足愈合的效果，對促使MSC細胞療法的臨床應(yīng)用廣泛開展具有重要經(jīng)濟意義和社會效益，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人臍帶血間充質(zhì)干細胞（MSC）購自廣州賽業(yè)生物有限公司（廣州，中國）。用含10% 胎牛血清（FBS，Gbico，USA），1μmol/L青霉素，100 U/mL鏈霉素（Sigma）的α-MEM基本培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC，第3～4代進行實驗。分別在α-MEM基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC實驗組、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC對照組、未轉(zhuǎn)染的MSC空白對照組，各組實驗條件相同。

1.2 MnSOD基因轉(zhuǎn)染MSC

上海生工生物有限公司設(shè)計MnSOD基因引物。pcDNA3.1-MnSOD由該實驗室構(gòu)建保存并提取質(zhì)粒DNA。添加500 μL 1%DNA-Lipofectamine2000，孵育48 h，PBS清洗，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測MnSOD基因的表達。

1.3 動物模型的建立

動物實驗得到齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準。按文獻記載[6]，選擇6周齡，體重（21.5±0.5）g的雄性C57BL/6J小鼠（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），以40 mg/kg鏈脲佐菌素，連續(xù)5 d腹腔注射，于7、14、21、28 d尾靜脈檢測血糖，空腹血糖持續(xù)>16.9 mmol/L為糖尿病小鼠；糖尿病模型成功后，顯微外科手術(shù)分別結(jié)扎股動脈起點和在膝關(guān)節(jié)處的分支，多普勒超聲在體檢測股動脈喪失血液供應(yīng)，即為結(jié)扎股動脈成功，然后在小鼠大腿后部做一個5×5 cm的圓形皮膚全層缺損，建立糖尿病足模型，模型鼠在恒溫、恒濕的代謝籠中單獨飼養(yǎng)[6]。

1.4 糖尿病足的治療以及取材

2×104 MSC、MnSOD-MSC、pcDNA3.1-MSC在糖尿病足傷口周圍3、6、9、12點位置注射，3、7、10、14 d觀察愈合效果并取材，每塊組織分為兩份，一份用4%多聚甲醛溶液固定用于免疫組化等實驗，另一份在-80 ℃保存待用。

1.5 糖尿病足傷口修復(fù)率

在治療后3、7、10、14 d，固定焦距、光圈等參數(shù)，以尼康D90數(shù)碼相機（日本）拍攝傷口，并以IPP圖像軟件測量傷口面積，計算傷口修復(fù)率[6]。傷口修復(fù)率=1-[各觀察點（3、7、10、14 d）測量傷口面積/ 0 d傷口面積]×100%

1.6 GSHPX、SOD檢測

收集-80℃保存的各組皮膚組織，0.01 mol/LPBS清洗2遍；冰浴下，用3 mL 50 mM Tris緩沖液（pH=7.5，含1 mM EDTA，10mM DTT，0.2% Triton X-100）裂解細胞；4 ℃，12 000×g，上清液使用Endogen公司生產(chǎn)的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽還原氧化酶（GSHPX）試劑盒測定SOD和GSHPX活性[7]。

1.6 統(tǒng)計方法

每組實驗至少重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，并進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組MSC表達MnSOD

Western blot檢測MnSOD-MSC實驗組，MSC對照組，空白質(zhì)粒組MnSOD蛋白表達，發(fā)現(xiàn)MnSOD-MSC組有外源性MnSOD表達，而空質(zhì)粒組和空白組無MnSOD蛋白表達，見圖1。

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圖1 MnSOD-MSC實驗組，空白質(zhì)粒組，MSC對照組MnSOD表達

2.2 糖尿病足愈合情況

相比空質(zhì)粒組，MnSOD-MSC實驗組可以明顯加快糖尿病足傷口愈合速度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

■

A. 各組治療糖尿病足的治愈率（%）。MnSOD-MSC實驗組與空質(zhì)粒組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.01（n=20）。B.各組典型照片。

圖2 各組治療糖尿病足的效果

2.3 各組SOD、GSHPX變化

空質(zhì)粒組SOD、GSHPX含量較低，MnSOD-MSC實驗組SOD、GSHPX含量與空質(zhì)粒組皮膚組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

3 討論

糖尿病傷口延遲愈合的形成與血管匱乏，血液供應(yīng)下降密切相關(guān)，雖然各種治療手段正被用于治療糖尿病潰瘍，但是效果不甚理想，所以促進糖尿病足的愈合一直是糖尿病研究領(lǐng)域的熱點[8]。傷口愈合時，各種組織和細胞、細胞因子等對損傷區(qū)進行填充[9]，使人們聯(lián)想到干（祖）細胞的應(yīng)用，間充質(zhì)干細胞（MSC）屬于多潛能干細胞，具有適應(yīng)局部微環(huán)境，多分化的特點，MSC在心血管損傷、腎功能衰竭、神經(jīng)和骨骼等許多人類疾病有廣泛應(yīng)用，對于DF這種兼有血管、神經(jīng)等混合性病變而言，MSC移植療法尤為合適[10]，該研究也發(fā)現(xiàn)利用MSC可以促使糖尿病足潰瘍愈合，與學(xué)者研究的結(jié)果一致。

糖尿病性高血糖會導(dǎo)致動脈發(fā)生硬化變性，出現(xiàn)微血管梗阻，導(dǎo)致組織局部缺氧而壞死。高血糖乏氧損傷會通過NADPH等途徑產(chǎn)生大量活性氧[11]，而糖尿病時高血糖狀態(tài)促使體內(nèi)抗氧化酶活性降低，機體清除自由基的能力受損，加重糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，這也是糖尿病足經(jīng)久不愈的原因之一[12]。文獻報道糖尿病鼠皮膚MnSOD蛋白等抗氧化酶的活性顯著降低[13]，該研究利用MnSOD轉(zhuǎn)染MSC可以促進糖尿病足的愈合，比空轉(zhuǎn)染組和對照組具有顯著差別，并證明在體模型上，MnSOD可以促進MSC分泌SOD等抗氧化酶類，保證MSC對抗自由基的損傷，達到促進組織修復(fù)的目的[14]。該研究也從側(cè)面驗證提高糖尿病足潰瘍周圍MnSOD蛋白等抗氧化酶的含量，可以對抗自由基損傷作用，同時避免MSC等細胞免受氧自由基的傷害，提示如果利用抗氧化酶轉(zhuǎn)染MSC、內(nèi)皮祖細胞（EPC）等干細胞，會保護干（祖）細胞免受活性氧的傷害，最大程度發(fā)揮細胞的作用。

雖然利用MnSOD轉(zhuǎn)染MSC治療糖尿病足取得一定效果，但是關(guān)于具體機制的研究，還需要深入探索，下一步將利用Western blot、實時定量PCR等方法檢測Akt等信號通路在MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC中具體機制，相關(guān)研究結(jié)果必將為在糖尿病足的干細胞療法的普及奠定研究基礎(chǔ)，其發(fā)揮的經(jīng)濟效益和社會效益非常巨大。

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（收稿日期：2014-02-13）