金波濤，于紹冰，鄭衛(wèi)衛(wèi)，于 潔，曹 巖

失重環(huán)境能引起機體血液動力學的改變，從而使心血管系統(tǒng)和咀嚼肌、骨骼肌發(fā)生一系列適應性變化。近年來，有關失重狀態(tài)下，咀嚼肌的變化逐漸得到學者的關注，由此是否可以引起對顳頜關節(jié)病(temporomandibular disorders，TMD)國內(nèi)外鮮有報道。為了進一步探討失重環(huán)境與TMD的關系，本研究擬采用尾部懸吊模擬失重大鼠模型，應用組織形態(tài)學方法，觀察失重不同時期對顳下頜關節(jié)(temporomandibular joint，TMJ)內(nèi)相關炎性因子TNF－α的表達，以探討其在顳下頜關節(jié)病發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1．1 實驗動物分組和方法 SD大鼠，一級，60只，體重(150±10)g，雄性，由山東大學動物中心提供。大鼠在實驗室適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，分別為懸吊1、3、5周及對照組，每組15只。懸吊組進行尾部懸吊［1］;對照組不做任何處理。動物實驗嚴格按照有關實驗室動物飼養(yǎng)及使用規(guī)則實施。各組大鼠在同一條件下以國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料單籠喂養(yǎng)，大鼠飼養(yǎng)籠具、飲水瓶定期消毒，使用墊料均經(jīng)高壓滅菌。稱量大鼠體重1次/5 d，自由進水飲食，室溫維持在(21±2)℃，相對濕度45% ～55%，動物飼養(yǎng)房實行12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)。

1．2 軟骨細胞的分離 直視下切取髁突軟骨層，放入盛有無鈣平衡鹽液(D－Hanks液)的平皿中，眼科剪盡量剪碎，移入離心管內(nèi)10倍量胰蛋白酶37℃振蕩，消化30 min，0．2%膠原酶II 37℃振蕩下消化2 h，10 ml混合培養(yǎng)基(含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，抗壞血酸50 U/ml)培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后首次換液，以后隔天換液。透明軟骨細胞長成單層后，進行傳代，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，0．5%胰蛋白酶約10 ml消化5 min，DMEM混合培養(yǎng)基反復吹打成單細胞懸液，消化傳代至平底24孔培養(yǎng)板，每孔種植細胞數(shù)約5×10G個。

1．3 TNF－α含量測定 用ELISA法定量測定大鼠髁突軟骨細胞培養(yǎng)物上清TNF－α含量，嚴格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。

1．4 總RNA提取 PBS0．01%mol/L，沖洗離心后加Catrimox－14AM等量簡單地粉碎細胞，GeneQuaant－pro-RNA/DNA定量RNA最后溶于RNA緩沖液中，吸取5 μl RNA樣品在20 μl反應體系中進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應條件:水浴5 min，37℃水浴5 min，37℃水浴60 min及 70 min 加熱 10 min，PCR 反應體系為 50 μl，擴增條件為:變性94℃ 30 s，復性50℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，循環(huán)35次，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察攝片。

1．5 髁突軟骨細胞分離純化 按常規(guī)方法以髁突軟骨細胞分離液分離靜脈血髁突軟骨細胞PBMC采用異硫氰酸胍一步法，嚴格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。cDNA合成:0．5%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的微量離心管中，依次進行。RT－PCR參數(shù):TNF－α循環(huán)參數(shù):94℃預變性3 min;變性94℃1 min，退火58℃115 min，延伸72℃2 min，循環(huán)30次;最后延伸2 min。引物設計如下:

TNF－α上游(5’－3’):AGG CGC TCC CCA AAA AGA TG;下游(5’－3’):TGG CGG AGA GGA GGC TGA CT。

β－actin上游(5’－3’):CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC;下游(5’－3’):CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT。

2 結果

TNF－αmRNA在懸吊1周表達最強，以后逐漸達到正常水平;懸吊1周組細胞因子mRNA升高最顯著，較懸吊3、5周2組有所下降并接近對照組。對照組變化不大，但與各懸吊組相比較明顯降低。見表1。

表1 各時點兩組TNF－αmRNA水平(n=15，±s)

表1 各時點兩組TNF－αmRNA水平(n=15，±s)

注:與對照組比較*P＜0．05

懸吊時間 對照組 懸吊組1 周 0．453 ±0．028 0．981 ±0．024*0．439 ±0．023 0．510 ±0．016 3 周 0．454 ±0．021 0．646 ±0．017 5周

3 討論

微重力或模擬失重環(huán)境會導致肌肉的結構、功能及電生理學特性發(fā)生一系列的變化，如肌肉趨于縮性改變［2］、收縮功能下降［1］、超微結構及生化特性的改變等［3］，但這些變化的分子機制尚不清楚。那么，與咬肌密切相關顳下頜關節(jié)是否會因為咬肌功能的變化而變化呢?從本文結果可以看出，這種模擬失重環(huán)境能夠引起顳下頜關節(jié)內(nèi)炎性因子發(fā)生變化。

目前，TMD的確切病因和發(fā)病機制尚不明了，有研究發(fā)現(xiàn)顳下頜關節(jié)紊亂癥患者的關節(jié)局部組織產(chǎn)生大量細胞因子TNF－α等，然而這些細胞因子對關節(jié)軟骨細胞增殖、代謝和凋亡的作用機制和影響途徑迄今尚無定論［4］。TNF－α由單核吞噬細胞和其它類型細胞產(chǎn)生并作用于這些細胞來調(diào)節(jié)黏附分子、免疫球蛋Fc受體、一氧化氮合成和金屬蛋白酶產(chǎn)生及其它細胞因子分泌，同時促進結締組織和內(nèi)皮細胞激活。其主要功能是致炎作用，并能直接或間接地介導骨組織吸收。已經(jīng)有證據(jù)表明TNF－α在軟骨細胞的降解－退變過程中起到最重要的分解作用。本文結果說明懸吊1、3、5周時，TMJ髁突軟骨有嚴重的炎性反應，而隨著時間增加，炎性反應會漸漸減輕，這可能因為筆者的研究采取了單一的失重模式，大鼠漸漸適應了這種方式的原因。

細胞因子是低分子量蛋白質(zhì)，是炎癥和免疫過程起始因子和效應器，其中TNF－β起重要作用。T細胞經(jīng)抗原刺激后表達IL－1受體，在IL－1作用下被活化，從而分泌 IL－2、IFN、GM －CSF、IL－4等細胞因子，增加T細胞表面MHC2類抗原的表達，誘導細胞毒性T淋巴細胞的分化，誘導單核/巨噬細胞產(chǎn)生TNF，并通過單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生IL－8介導對中性粒細胞的趨化作用，加速血纖維蛋白原、C反應蛋白等的合成［5］。TNF－活化單核/巨噬細胞，提高其殺傷活性，釋放超氧、促進NO、IL－2等細胞因子的產(chǎn)生，促進中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞粘附到內(nèi)皮細胞上，從而參與炎癥反應［6］。

［1］ZB，Zhang LF，Jin JP．A proteolytic NHZ －terminal truncation of cardiac troponin I that is up － regulated in simulated microgravity［J］．J Biol Chem，2001，276(19):15753 －15760．

［2］List T，Wahlund K，Larsson B．Psychosocial functioning and dental factors in adolescents with temporomandibular disorders:a casecontrol study［J］．J Orofac Pain，2001，15(3):218 －227．

［3］Zhang L，Wang YY，Yu ZB．Depressed responsiveness of cardiomyocytes to isoproterenol in simulated weightlessness rats［J］．Acta Physiol Sin，2007，59(6):845 －850．

［4］ Convertino VA．Status of cardiovascular issues related to space flight:Implications for future research directions［J］．Respir Physio1 Neurobiol，2009，169(Suppl 1):s34 － s37．

［5］Dalekos GN，Elisaf M，Bairaktarl E，et al．Increased serum levels of interleuk in－1 in the systemic circulation of patients with essential hyperten sive patients［J］．J Lab Clin Med，1997，129(3):300－305．

［6］Futrakul N，Buthep P，Patumarys，et al．Enhanced tumor necrosis factor in the serum and renal hyperfusion in nephrosis associated with focal segment glomerlo-sclerosis［J］．Ren Fail，2002，22(2):213－215．