施慶顏， 靳 華， 曾靖華， 鄺少華， 黃世光△

慢性根尖周病是一種以炎癥破壞為特征的疾病，炎癥性骨吸收是由根尖周組織中的免疫活性細(xì)胞或炎癥細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子(cytokine，CK)介導(dǎo)。研究顯示IL-1β和IL-17在關(guān)節(jié)炎和牙周炎中起關(guān)鍵作用［1-2］，同時(shí) IL-1β和IL-17也存在于根尖周病變組織中［3-4］。盡管進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究，但是參與根尖周病發(fā)生和疾病持續(xù)的免疫細(xì)胞和CK尚未闡明，參與根尖周病的IL-1β和IL-17的表達(dá)還不清楚。傳統(tǒng)認(rèn)為肥大細(xì)胞(mast cells，MCs)是過敏性炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，除了在過敏性炎癥反應(yīng)中起作用外，MCs還可通過眾多介質(zhì)的表達(dá)既參與IgE依賴又參與IgE非依賴的免疫反應(yīng)［5］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)MCs是重要的效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均有重要作用［6］。關(guān)于MCs的CK參與根尖周病尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文采用免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病中MCs的分布情況并分析MCs細(xì)胞因子IL-1β及IL-17的表達(dá)情況，研究結(jié)果對(duì)于闡明MCs細(xì)胞因子IL-1β及IL-17在根尖周病發(fā)病機(jī)制中的作用具有理論意義及臨床指導(dǎo)價(jià)值。

材料和方法

1 研究對(duì)象

1.1 病例選擇 選擇2007年7月至2013年6月期間在暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心臨床診斷為根尖囊腫和根尖肉芽腫，并接受根尖刮治手術(shù)的病例。根尖肉芽腫和根尖囊腫的病例由暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科的2名病理醫(yī)生從資料庫的100例根尖周病病例中挑出，病理診斷為根尖肉芽腫32例(年齡24～65歲，平均40.2歲)、根尖囊腫35例(年齡20～58歲，平均38.9歲)，排除急性炎癥和其它疾病。對(duì)照組35例(年齡17～24歲，平均21.5歲)為正常牙周膜，來自2013年12月期間在暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬惠州口腔醫(yī)院牙周健康的因正畸需要拔除的前磨牙，這些前磨牙牙根發(fā)育完全并且沒有根尖及牙周病變。所有患者均沒有系統(tǒng)性疾病而且至少2個(gè)月前停止使用抗生素。在樣本收集之前取得患者的書面知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 本研究共收集樣本102例，分為(1)根尖肉芽腫組:X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區(qū)，直徑＜1 cm，邊界清楚，組織學(xué)檢查見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并無鱗狀上皮襯里，共32例;(2)根尖囊腫組:X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區(qū)，直徑＞1 cm，邊界清楚有骨白線包繞，組織學(xué)檢查見根尖區(qū)組織存在部分或全部上皮覆蓋，囊腫表現(xiàn)為完整的囊腔，囊腔為一定厚度的復(fù)層鱗狀上皮覆蓋，囊壁存在纖維組織并有中-重度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，共35例;(3)正常對(duì)照組:因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共35例。

2 方法

2.1 組織標(biāo)本采集和處理 正常對(duì)照組標(biāo)本取自因正畸需要拔除的前磨牙，用無菌刀片將牙周膜從牙根上刮取，樣本立即固定于4%中性甲醛緩沖溶液中48 h以上。經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成5 μm厚度組織連續(xù)切片。根尖肉芽腫和根尖囊腫為保存石蠟塊，選取符合要求的標(biāo)本進(jìn)行組織連續(xù)切片。

2.2 HE染色及組織學(xué)觀察 組織切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組標(biāo)本的組織學(xué)改變。由2名病理醫(yī)師盲法觀察，并對(duì)根尖肉芽腫、根尖囊腫病變組織以及正常對(duì)照組健康牙周膜組織的炎癥程度進(jìn)行評(píng)分，求其平均值。炎癥程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Huang等［7］的方法:0，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);1，輕度炎癥，炎癥細(xì)胞局部呈小灶狀浸潤(rùn);2，中度炎癥，炎癥細(xì)胞呈灶狀及片狀浸潤(rùn);3，重度炎癥，炎癥細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)。

2.3 IL-1β和IL-17陽性肥大細(xì)胞免疫熒光雙染色

Ⅰ抗:tryptase抗體(Abcam)，稀釋濃度為1∶200;IL-1β(Santa Cruz Biotechnology)和 IL-17抗體(Abcam)稀釋濃度為1∶100。Ⅱ抗:山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour 555?和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour 488?(Cell Signaling Technology)，稀釋濃度為1∶200。組織切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、乙醇復(fù)水，檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)、山羊血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色后，立即在熒光顯微鏡下觀察。Tryptase免疫熒光陽性信號(hào)為綠色熒光，IL-1β和IL-17均顯示紅色熒光，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，同一視野下tryptase綠色熒光分別與IL-1β和IL-17紅色熒光重疊后為橘黃色熒光。由2名病理醫(yī)師于免疫熒光顯微鏡下觀察到MCs均表達(dá)有IL-1β和IL-17，從而對(duì)各組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中IL-1β和IL-17陽性的 MCs計(jì)數(shù)并計(jì)算各組IL-1β和IL-17陽性MCs密度(mm－2)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。不同組間組織炎癥程度評(píng)分以及多組間每平方毫米 IL-1β和IL-17陽性MCs數(shù)目的比較均采用 Kruskal-Wallis檢驗(yàn);采用Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立樣本兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織學(xué)觀察

正常對(duì)照組未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A、B);根尖囊腫上皮層可見中、重度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn):表現(xiàn)為細(xì)胞間水腫和以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C、D);根尖肉芽腫表現(xiàn)為重度炎癥反應(yīng)，可見毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生，有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞散在浸潤(rùn);在炎癥肉芽組織周圍見纖維組織增生，肉芽組織中有泡沫細(xì)胞呈灶性分布(圖1E、F)。

Figure 1.Histology of the specimens(HE staining).A，B:healthy control group;C，D:periapical cyst group;E，F(xiàn):periapical granuloma group.A，C，E:×200;B，D，F(xiàn):×400.圖1 各組標(biāo)本的組織學(xué)觀察

各組標(biāo)本組織炎癥程度評(píng)分比較見圖2，結(jié)果顯示3組標(biāo)本組織炎癥反應(yīng)程度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽腫組炎癥反應(yīng)程度最高(平均秩為77.00)。Nemenyi檢驗(yàn)結(jié)果顯示:正常對(duì)照組與根尖囊腫組組織炎癥程度之間存在顯著差異(P＜0.01);正常對(duì)照組與根尖肉芽腫組組織炎癥程度之間有顯著差異(P＜0.01);根尖囊腫組與根尖肉芽腫組組織炎癥程度無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.Inflammation score in the specimen.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.圖2 各組標(biāo)本組織的炎癥程度評(píng)分

2 IL-1β陽性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中IL-1β陽性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，各組標(biāo)本組織MCs均表達(dá)IL-1β。正常對(duì)照組:牙周膜組織中只見少量散在分布的IL-1β陽性MCs(圖3A、B、C);根尖囊腫組:組織中IL-1β陽性MCs數(shù)目顯著增多，且MCs有脫顆?，F(xiàn)象(圖3D、E、F);根尖肉芽腫組:組織中出現(xiàn)大量的IL-1β陽性MCs，且MCs伴明顯脫顆?，F(xiàn)象(圖3G、H、I)。

Figure 3.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-IL-1β immunofluorescence double staining(×1 000).A～C:healthy control group;D～F:periapical cyst group;G～I(xiàn):periapical granuloma group.A，D，G:tryptase;B，E，H:IL-1β;C，F(xiàn)，I:merged.圖3 各組標(biāo)本組織中的IL-1β陽性MCs

各組標(biāo)本組織中IL-1β陽性MCs密度見圖4，結(jié)果顯示3組標(biāo)本 IL-1β陽性 MCs密度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽腫組IL-1β陽性MCs密度最高(平均秩為75.09)。Nemenyi檢驗(yàn)結(jié)果顯示:正常對(duì)照組與根尖囊腫組IL-1β陽性MCs密度之間存在顯著差異(P＜0.01);正常對(duì)照組與根尖肉芽腫組IL-1β陽性MCs密度之間有顯著差異(P＜0.01);根尖囊腫組與根尖肉芽腫組IL-1β陽性MCs密度無顯著差異(P ＞0.05)。

Figure 4.The density of IL-1β positive MCs.M A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.圖4 各組標(biāo)本組織中IL-1β陽性的MCs密度

3 IL-17陽性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中IL-17陽性肥大細(xì)胞免疫熒光雙染色結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，各組標(biāo)本組織MCs均表達(dá)IL-17。在正常對(duì)照組，牙周膜組織中只見少量散在分布的IL-17陽性MCs(圖5A、B、C);根尖囊腫組:組織中IL-17陽性MCs數(shù)目顯著增多，且MCs有脫顆?，F(xiàn)象(圖5D、E、F);在根尖肉芽腫組，組織中出現(xiàn)大量的IL-17陽性MCs，且MCs伴明顯脫顆?，F(xiàn)象(圖5G、H、I)。

各組IL-17陽性MCs密度見圖6，結(jié)果顯示3組標(biāo)本IL-17陽性MCs密度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽腫組 IL-17陽性 MCs密度最高(平均秩為76.92)。Nemenyi檢驗(yàn)結(jié)果顯示:正常對(duì)照組與根尖囊腫組IL-17陽性MCs密度之間存在顯著差異(P＜0.01);正常對(duì)照組與根尖肉芽腫組IL-17陽性MCs密度之間有顯著差異(P＜0.01);根尖囊腫組與根尖肉芽腫組IL-17陽性MCs密度無顯著差異(P＞0.05)。

4 IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度相關(guān)性分析

Figure 5.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-IL-17 immunofluorescence double staining(×1 000).A～C:healthy control group;D～F:periapical cyst group;G～I(xiàn):periapical granuloma group.A，D，G:tryptase;B，E，H:IL-17;G，F(xiàn)，I:merged.圖5 各組標(biāo)本組織中的IL-17陽性MCs

Figure 6.The density of IL-17 positive MCs.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.圖6 各組標(biāo)本組織中IL-17陽性的MCs密度

各組IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關(guān)系見圖7。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，慢性根尖周炎組織炎癥程度顯著增加(P＜0.01)。同時(shí)，隨著根尖周組織炎癥程度的增加，IL-1β陽性MCs密度也隨之增加。經(jīng)Pearson相關(guān)分析及直線回歸分析，3組標(biāo)本組織中IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度密切相關(guān)，且存在正的直線相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

5 IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度相關(guān)性分析

各組IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關(guān)系見圖8。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，慢性根尖周炎組織炎癥程度顯著增加(P＜0.01)。同時(shí)，隨著根尖周組織炎癥程度的增加，IL-17陽性MCs密度也隨之增加。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，3組標(biāo)本組織中IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度密切相關(guān)，且存在正的直線相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

Figure 7.Correlation analysis between density of IL-1β positive MCs and inflammation score.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).圖7 各組標(biāo)本IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關(guān)系

Figure 8.Correlation analysis between density of IL-17 positive MCs and inflammation score.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).圖8 各組標(biāo)本IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關(guān)系

討 論

研究表明來源于感染根管的微生物是根尖周疾病的主要病因，根尖周疾病通常伴有根尖周的骨吸收，目前關(guān)于根尖周感染致骨吸收的致病機(jī)制尚未闡明。體外骨吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β是最活躍的骨吸收因子［8］。有報(bào)道指出 IL-1β、IL-1α 和 TNF-α在體內(nèi)也能刺激骨吸收［9-10］，這些介質(zhì)在體外也能發(fā)揮相似的作用，表明它們?cè)诠俏招约膊〉闹虏C(jī)制中具有潛在的作用。IL-17是一種促炎介質(zhì)，研究顯示IL-17在骨破壞性疾病中顯著升高，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎［1］，同時(shí) IL-17也存在于根尖周病中［3-4］，表明Th17細(xì)胞也可能促進(jìn)組織破壞，包括根尖周骨破壞。目前，IL-17在根尖周病中的具體作用機(jī)制還不清楚［11］。

傳統(tǒng)認(rèn)為MCs是過敏性炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，除了在過敏性炎癥反應(yīng)中起作用外，MCs還可通過眾多介質(zhì)的表達(dá)既參與IgE依賴又參與IgE非依賴的免疫反應(yīng)［12］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)MCs是重要的效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫均有重要作用［13］。MCs在根尖周疾病中的作用，目前尚無統(tǒng)一的看法。MCs在根尖肉芽腫和囊腫中均有發(fā)現(xiàn)，并且囊腫中MCs比肉芽腫多［14］。de Noronha Santos Netto等［15］在根尖囊腫的炎癥病變區(qū)觀察到肥大細(xì)胞數(shù)量增多，而且在病變的深層組織中出現(xiàn)明顯的脫顆粒MCs，提示MCs與牙源性病變的炎癥反應(yīng)和囊性病變有關(guān)。等［16］觀察到囊腫MCs數(shù)量比肉芽腫多，且MCs主要出現(xiàn)在根尖周病變的炎性浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞區(qū)域。Ledesma-Montes等［17］觀察到在有上皮增生的肉芽腫中MCs增多較多，膿腫部位MCs數(shù)量較少，提示MCs與根尖周炎癥進(jìn)程的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)存在密切關(guān)系。我們的研究結(jié)果顯示，根尖肉芽腫和囊腫MCs數(shù)量較正常對(duì)照明顯增多，但MCs數(shù)量在肉芽腫和囊腫無明顯差異。

根尖周病中活化的MCs既可以分泌IL-1又可以分泌IL-17，盡管IL-1不是作為CTMC中一種預(yù)先合成的介質(zhì)存在［18-19］。MCs的活化以及隨之而來的脫顆粒，存在于細(xì)胞外環(huán)境中的Tryptase能激活MCs釋放 IL-1β［20］。IL-1、IL-17 作為一種促炎介質(zhì)，可引起根尖周組織的炎癥反應(yīng)及破骨細(xì)胞生成和骨吸收。

本實(shí)驗(yàn)我們采用免疫熒光雙染色法首次證實(shí)了人類慢性根尖周病組織中的肥大細(xì)胞表達(dá)IL-1β和IL-17。我們的研究結(jié)果顯示，慢性根尖周病組織中IL-1β和IL-17陽性MCs數(shù)目顯著高于正常對(duì)照組;同時(shí)，隨著根尖周組織炎癥程度的增加，IL-1β和IL-17陽性MCs密度也隨之增加;提示IL-1β和IL-17陽性MCs可能在慢性根尖周炎的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。因此，控制MCs IL-1β和IL-17的合成或者調(diào)節(jié)MCs的功能可能成為阻止根尖周病發(fā)展的一個(gè)治療目標(biāo)，從而為根尖周病的治療提供新的靶點(diǎn)。

［1］ Sato K，Suematsu A，Okamoto K，et al.Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction［J］.J Exp Med，2006，203(12):2673-2682.

［2］ Ohyama H，Kato-Kogoe N，Kuhara A，et al.The involvement of IL-23 and the Th17 pathway in periodontitis［J］.J Dent Res，2009，88(7):633-638.

［3］ Xiong H，Wei L，Peng B.Immunohistochemical localization of IL-17 in induced rat periapical lesions［J］.J Endod，2009，35(2):216-220.

［4］ 孫 輝.IL-17F在人慢性根尖周炎中的定位表達(dá)研究［D］.合肥:安徽醫(yī)科大學(xué)，2012.

［5］ Beunk L，Verwoerd A，van Overveld FJ，et al.Role of mast cells in mucosal diseases:current concepts and strategies for treatment［J］.Expert Rev Clin Immunol，2013，9(1):53-63.

［6］ Shelburne CP，Abraham SN.The mast cell in innate and adaptive immunity［J］.Adv Exp Med Biol，2011，716:162-185.

［7］ Huang S，Lu F，Zhang Z，et al.The role of psychologic stress-induced hypoxia-inducible factor-1alpha in rat experimental periodontitis［J］.J Periodontol，2011，82(6):934-941.

［8］ Bertolini DR，Nedwin GE，Bringman TS，et al.Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumor necrosis factors［J］.Nature，1986，319(6053):516-518.

［9］ K?nig A，Mühlbauer RC，F(xiàn)leisch H.Tumor necrosis factor α and interleukin-1 simulate bone resorption in vivo measured by urinary［3H］tetracycline excretion from prelabeled mice［J］.J Bone Miner Res，1988，3(6):621-627.

［10］ Sabatini M，Boyce B，Aufdemorte T，et al.Infusions of recombinant human interleukins 1 alpha and 1 beta cause hypercalcemia in normal mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1988，85(14):5235-5239.

［11］Wei S，Kawashima N，Suzuki N，et al.Kinetics of Th17-related cytokine expression in experimentally induced rat periapical lesions［J］.Aust Endod J，2013，39(3):164-170.

［12］藍(lán) 田，呂芳麗，李 娟，等.肥大細(xì)胞Toll樣受體4在人慢性牙周炎牙齦組織中的表達(dá)［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(8):1476-1480.

［13］李 娟，尹小萍，藍(lán) 田，等.Tryptase和TIM-1雙陽性肥大細(xì)胞在不同程度人牙周炎組織中的量化研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(5):892-896.

［14］ Fonseca-Silva T，Santos CC，Alves LR，et al.Detection and quantification of mast cell，vascular endothelial growth factor，and microvessel density in human inflammatory periapical cysts and granulomas［J］.Int Endod J，2012，45(9):859-864.

［15］de Noronha Santos Netto J，Pires FR，da Fonseca EC，et al.Evaluation of mast cells in periapical cysts，dentigerous cysts，and keratocystic odontogenic tumors［J］.J Oral Pathol Med，2012，41(8):630-636.

［16］ Dra?ic′R，Sopta J，Minic′AJ.Mast cells in periapical lesions:potential role in their pathogenesis［J］.J Oral Pathol Med，2010，39(3):257-262.

［17］ Ledesma-Montes C，Garcés-Ortíz M，Rosales-García G，et al.Importance of mast cells in human periapical inflammatory lesions［J］.J Endod，2004，30(12):855-859.

［18］Klein LM，Lavker RM，Matis WL，et al.Degranulation of human mast cells induces an endothelial central to leukocyte adhesion［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86(22):8972-8976.

［19］ Kaminer MS，Murphy GF，Walsh LJ，et al.Extracellular localization of human connective tissue mast cell granule contents［J］.J Invest Dermatol，1991，96(6):857-863.

［20］Waldorf HA，Walsh LJ，Schechter NM，et al.Early cellular events during evolving cutaneous delayed hypersensitivity in humans［J］.Am J Pathol，1991，138(2):477-486.