李佳佳， 陳茵婷， 曾林涓， 練國達(dá)， 陳少杰， 李雅晴， 黃開紅△

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和長期生存率低的特點［1］。除了手術(shù)治療和化療，基因治療是一個具有前景的治療方法，而發(fā)展一種安全、高效和腫瘤靶向性的基因輸送體系是基因治療的關(guān)鍵。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)是最為廣泛應(yīng)用的納米載體，其具有陽性電荷，能與帶陰性電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，獲得較高的轉(zhuǎn)染率［2］。IONP(iron oxide nanocrystal with carboxylic acid group)是一種能向細(xì)胞輸送藥物且具有磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)功能的載體［3］?？?CD44v6 單鏈抗體 (anti-CD44v6 single chain variable fragment，scFvCD44v6)是一種具有高度親和力和靶向性的抗黏附因子，能夠靶向地識別CD44v6陽性的腫瘤細(xì)胞［4］。課題組前期研究表明，載藥(基因)納米微粒與單克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)制成免疫納米微粒，可提高藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性，達(dá)到提高療效和降低毒副作用的目的［5-6］。本研究將IONP、PEI及 scFvCD44v6復(fù)合，制備一種高效、靶向地向胰腺癌細(xì)胞輸送siRNA的免疫納米載體。

材料和方法

1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1(KRAS突變型)購自上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所;胎牛血清和高糖型DMEM培養(yǎng)基(Gibco);PEI和MAL-PEG-NHS{O-［N-(3-maleimidopropionyl)aminoethyl］-O-［3-(N-succinimidyloxy)-3-oxopropyl］heptacosaethylene glycol}購自Sigma;IONP購自美國大洋納米科技公司;兔抗人KRAS單克隆抗體購自Gene Tex;小鼠抗人Tubulin單克隆抗體購自Cell Signaling;FITC標(biāo)記小鼠抗6×His-tag單克隆抗體購自AbD。CD44v6單鏈抗體按本課題組已建立的方法合成;siKRAS和siNC(negative control)由上海吉瑪公司設(shè)計合成;Cy3.3-siNC由廣州銳博公司設(shè)計合成。

2 方法

2.1 IONP-PEI的制備及其表征的檢測 IONP和PEI分別溶于滅菌的去離子水稀釋，IONP質(zhì)量為5 μg，與PEI按照不同質(zhì)量比混勻，室溫下靜置20min，得到不同質(zhì)量比的IONP-PEI復(fù)合物。用去離子水稀釋至1 500 μL，Zeta-Plus粒度分析儀測粒徑和電位。每個樣本測5次。

2.2 IONP、PEI以及 IONP/PEI的細(xì)胞毒性測定Panc-1細(xì)胞接種于96孔板，每孔8×103個細(xì)胞，總體積100 μL，3個復(fù)孔，貼壁生長24 h后去除舊培養(yǎng)基，加入一定濃度 IONP、PEI、IONP/PEI及新鮮培養(yǎng)基，空白組僅含 DMEM培養(yǎng)基，對照組含細(xì)胞和DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，去除舊培養(yǎng)基，每孔加入80 μL 新鮮培養(yǎng)基和 20 μL MTS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度。獨立重復(fù)3次。

2.3 IONP-PEI/siRNA的制備及其表征的檢測 按IONP 質(zhì)量為5 μg，IONP 和 PEI質(zhì)量比為 0.75，制備IONP-PEI復(fù)合物;按照不同N/P比值向復(fù)合物中加入siRNA，混勻，室溫下孵育20 min，得到不同 N/P比的IONP-PEI/siRNA復(fù)合物。去離子水稀釋至1 500 μL，Zeta-Plus粒度分析儀測粒徑和電位。每個樣本測5次。

2.4 瓊脂糖凝膠阻滯電泳 制備不同N/P比值IONP-PEI/siRNA復(fù)合物，siRNA量設(shè)定為10 pmol，IONP和PEI的質(zhì)量比為0.75。將復(fù)合物與6×DNA上樣緩沖液、膠體金混勻后上樣，1%的瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液，恒壓100V電泳20 min;在UV凝膠成像儀上觀察條帶并照相。

2.5 不同N/P比值的IONP-PEI/siRNA對細(xì)胞的毒性 Panc-1細(xì)胞接種在96孔板，每孔8×103個細(xì)胞，總體積100 μL，3個復(fù)孔，貼壁生長24h去除舊培養(yǎng)基，加入不同N/P比值的IONP-PEI/siRNA，siRNA的終濃度設(shè)定為100 nmol/L，IONP和PEI的質(zhì)量比為0.75?？瞻捉M僅含DMEM培養(yǎng)基，對照組含細(xì)胞和DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，去除舊培養(yǎng)基，每孔加入80 μL新鮮培養(yǎng)基和20 μL MTS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 3 h，酶標(biāo)儀 490 nm處測吸光度。獨立重復(fù)3次。

2.6 scFvCD44v6-IONP-PEI/siRNA 的制備 制備IONP-PEI復(fù)合物;將MAL-PEG-NHS溶于滅菌去離子水，與PEI按照摩爾比為10∶1加入復(fù)合物中，混勻，室溫孵育30 min;將已制備的scFvCD44v6與PEI按照質(zhì)量比為1∶1加入上述復(fù)合物中，4℃過夜，使用前5 kD的Millipore超濾離心管3 000 r/min離心10 min去除游離的抗體，得到scFv-IONP-PEI，與siRNA按照 N/P=20復(fù)合，室溫孵育20min，得到 scFv-IONP-PEI/siRNA。

2.7 轉(zhuǎn)染率的測定 Panc-1細(xì)胞每孔5×104個接種在24孔板，貼壁生長24 h。制備不同N/P比值的IONP-PEI/siNC-FAM和N/P比值為20的scFv-IONP-PEI/siNC-FAM，Lipo-2000做陽性對照。siNCFAM的終濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h后棄上清，胰酶消化細(xì)胞離心，PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測熒光率。以上均為避光操作，獨立重復(fù)3次。

2.8 細(xì)胞免疫熒光 制備 scFv-IONP-PEI/siNCCy3，轉(zhuǎn)染6 h后，棄上清，PBS輕洗，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 輕洗，0.2%Triton X-100/PBS 室溫透化10 min;PBS輕洗，1%BSA/PBS室溫低速搖床封閉30 min;去除封閉液，孵育FITC標(biāo)記小鼠抗6×His-tag單克隆抗體(10 mg/L)，室溫低速搖床孵育30 min;去除抗體，PBS輕洗，Hoechest 33342工作液染核5 min，PBS輕洗;加入PBS，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。觀察結(jié)束后，去除PBS，加入含3%HCl和1%亞鐵氰化鉀的普魯士藍(lán)染色液，37℃孵育30 min。去除染色液，PBS輕洗后顯微鏡下觀察鐵染色。

2.9 實時熒光定量 PCR(real-time PCR)檢測IONP-PEI/siKRAS和scFv-IONP-PEI/siKRAS轉(zhuǎn)染48 h后，以Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green染料法，羅氏熒光PCR儀進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，引物設(shè)計如下:KRAS-F:5’-CAGGGTACTTCATTGATGCCACAAC-3’;KRAS-R:5’-GCTGGTCTCCAGGTAACGAACAATA-3’;GAPDH-F:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’;GAPDH-R:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反應(yīng)條件:95℃ 2 min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95℃ 30 s變性，60℃退火35 s，45 個循環(huán)。

2.10 Western印跡分析(Western blotting) IONPPEI/siKRAS和scFv-IONP-PEI/siKRAS轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h;冷PBS洗2次，用含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，BCA法測定總蛋白濃度。取等量總蛋白于10%SDS-PAGE膠電泳。然后將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至 PVDF膜中，恒流(200 mA)轉(zhuǎn)膜90 min。取出PVDF膜，置于5%脫脂奶粉中封閉 2 h。加入Ⅰ抗(KRAS 1∶1 000，Tubulin 1∶2 000)，4℃過夜，TBST洗膜;Ⅱ抗37℃搖床孵育1 h，TBST洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，曝光。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用χ2和t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 表征檢測

IONP-PEI復(fù)合物的粒徑和電位隨著質(zhì)量比的增大而逐漸減少，在IONP/PEI的質(zhì)量比等于0.75的時候，復(fù)合物的電位為(25.53±2.10)mV，粒徑為(45.0±3.1)nm，見表1。較小的粒徑和微弱的表面正電利于細(xì)胞內(nèi)吞，故選擇IONP/PEI的質(zhì)量比為0.75制備不同 N/P比值的 IONP-PEI/siRNA，隨著N/P比值的增加，該復(fù)合物電位逐漸增大，提示siRNA復(fù)合得更加完全;粒徑則趨于較穩(wěn)定的狀態(tài)，見表2。

表1 不同質(zhì)量比IONP-PEI復(fù)合物的電位和粒徑Table 1.The particle size and zeta potential of IONP-PEI complexes(Mean±SD.n=5)

表2 不同N/P比值IONP-PEI/siRNA復(fù)合物的電位和粒徑Table 2.The particle size and zeta potential of IONP-PEI/siRNA complexes(Mean±SD.n=5)

2 MTS法測細(xì)胞存活率

當(dāng)濃度為 0.01 g/L時，IONP、PEI和 IONP-PEI復(fù)合物的細(xì)胞毒性都不大，但隨著濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降。當(dāng)濃度為0.5 g/L時，細(xì)胞活力分別降至(51.77 ±7.80)%、(65.14 ±3.82)%、(58.53 ±3.38)%，見圖1A。IONP-PEI/siRNA的細(xì)胞毒性隨著N/P比值的增大逐漸增大，在N/P=5時，細(xì)胞存活率為(102.97 ±2.94)%，N/P=40 時，細(xì)胞存活率降為(93.30 ±3.21)%，見圖1B。

Figure 1.Cytotoxicity induced by the polymers of a variety of concentrations in Panc-1 cells(A)and cytotoxicity induced by IONP-PEI/siRNA complexes at different N/P ratios after transfection into Panc-1 cells(B).Mean ±SD.n=3.圖1 不同濃度的PEI、IONP和IONP-PEI和不同N/P比值的IONP-PEI/siRNA對Panc-1細(xì)胞的毒性

3 瓊脂糖凝膠實驗

N/P=1時，從復(fù)合物中泳出的siRNA條帶的亮度較裸siRNA條帶明顯減弱，表明siRNA的負(fù)電荷被陽離子聚合物部分中和。當(dāng)N/P升至15時，泳出的siRNA條帶的亮度非常弱，上升至20或以上，復(fù)合物中沒有siRNA泳出，提示siRNA的負(fù)電荷被陽離子聚合物完全中和，見圖2。

4 轉(zhuǎn)染率測定、熒光顯微鏡觀察

N/P比值為5時，轉(zhuǎn)染率為(16.55±1.68)%;隨著N/P比值增加，轉(zhuǎn)染率逐漸增加，N/P比值為20時，轉(zhuǎn)染率為(59.87±4.52)%，見圖3。在最適N/P比值下，既具有較高的轉(zhuǎn)染率，同時對細(xì)胞的活力影響不大，綜合細(xì)胞毒性、瓊脂糖凝膠電泳以及轉(zhuǎn)染率的結(jié)果，我們選擇N/P比值為20進(jìn)行后續(xù)試驗。為了比較scFv靶向組和非靶向組的轉(zhuǎn)染率，分別于轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞6 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染率檢測和熒光顯微鏡觀察;非靶向組的轉(zhuǎn)染率為(59.87±4.52)%，靶向組的轉(zhuǎn)染率為(89.75±1.81)%，靶向組的轉(zhuǎn)染率明顯高于非靶向組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4;且熒光顯微鏡觀察靶向組的紅色熒光強度高于非靶向組，見圖5。

Figure 2.Gel electrophoresis of IONP-PEI/siRNA complexes at different N/P ratios.Lane 1:naked siRNA;Lane 2:IONP-PEI/siRNA at N/P=1;Lane 3:IONP-PEI/siRNA at N/P=5;Lane 4:IONP-PEI/siRNA at N/P=7.5;Lane 5:IONP-PEI/siRNA at N/P=10;Lane 6:IONP-PEI/siRNA at N/P=15;Lane 7:IONPPEI/siRNA at N/P=20;Lane 8:IONP-PEI/siRNA at N/P=30;Lane 9:IONP-PEI/siRNA at N/P=40.圖2 不同N/P比值的IONP-PEI/siRNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳

Figure 3.The transfection efficiencies of IONP-PEI/siRNA at different N/P ratios measured by flow cytometry.Mean±SD.n=3.圖3 不同N/P比值IONP-PEI/siRNA的轉(zhuǎn)染效率

Figure 4. The transfection efficiencies of IONP-PEI/siRNA，scFv-IONP-PEI/siRNA and lipo/siRNA measured by flow cytometry.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs IONP-PEI/siRNA.圖4 非靶向組IONP-PEI和靶向組scFv-IONP-PEI轉(zhuǎn)染效率的比較

Figure 5.Fluorescence images of Panc-1 cells transfected with siNC-Cy3 by scFvCD44v6-IONP-PEI and IONP-PEI at an N/P ratio of 20 were investigated under a fluorescence microscope.圖5 靶向的scFv-IONP-PEI和非靶向的IONP-PEI轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況

5 細(xì)胞免疫熒光及普魯士藍(lán)染色

scFv-IONP-PEI/siNC-Cy3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光;多聚甲醛固定，F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗6×His-tag單克隆抗體孵育，由于scFvCD44v6帶有His-tag標(biāo)簽蛋白，所以出現(xiàn)綠色熒光，證實 scFvCD44v6與IONP-PEI偶聯(lián)成功;普魯士藍(lán)染色胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒;以上結(jié)果均表明 scFv-IONP-PEI/siNC-Cy3成功地進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，見圖6。

Figure 6.Fluorescence and Prussian blue staining images of Panc-1 cells transfected with siNC-Cy3 by scFvCD44v6-IONP-PEI at an N/P ratio of 20 were investigated under a fluorescence microscope.IONP in the cells were detected as blue-stained cells.Nucleus in the cells was measured using the DNA-binding dye Hoechst 33342.Red fluorescence indicated the siNC-Cy3.Green fluorescence from the fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated mouse monoclonal antibody appeared in the scFvCD44v6-IONP-PEI group，indicating that scFvCD44v6had successfully attached to IONP-PEI.圖6 scFvCD44v6-IONP-PEI/siNC-Cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后的細(xì)胞免疫熒光及普魯士藍(lán)染色實驗

6 Real-time PCR和Western blotting檢測KRAS mRNA和蛋白的表達(dá)水平

靶向組的KRAS mRNA的相對表達(dá)量為對照組的(34.02±6.15)%，低于非靶向組的相對表達(dá)量(51.09 ±6.70)%，有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。Western blotting表明，兩者的蛋白表達(dá)量均低于對照組的表達(dá)量，見圖7，說明scFv-IONP-PEI可以有效地輸送和釋放siRNA，從而發(fā)揮干擾效果。

Figure 7.The result of RT-PCR analysis and Western blotting after transfection with IONP-PEI/siKRAS and scFv-IONP-PEI/siKRAS.A:IONP-PEI/siKRAS;B:scFv-IONP-PEI/siKRAS;control:no treatment group.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs A.圖7 不同組別轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后的real-time PCR和Western blotting結(jié)果分析

討 論

胰腺癌是嚴(yán)重危及人類健康的重大疾病，其發(fā)病隱匿、預(yù)后差［7］;大部分患者在確診時處于晚期，目前主要治療方法有手術(shù)和化療，這些方法對患者產(chǎn)生一定的打擊和損害，且療效不能令人滿意。隨著對腫瘤發(fā)生機制的研究，以抑制癌基因表達(dá)為重要內(nèi)容之一的基因治療成為人們關(guān)注熱點，被認(rèn)為是新世紀(jì)人類攻克惡性腫瘤的希望所在［8］?；蛑委煹哪繕?biāo)是將外源基因靶向性輸送到腫瘤組織，其能夠成功進(jìn)行依賴于合適的基因載體。納米載體是近年倍受關(guān)注的新型基因載體，與脂質(zhì)體及其它非病毒載體相比，其性質(zhì)比較穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)靈活，易調(diào)整分子量，可以通過引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來修飾多聚物骨架，進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，其體積比脂質(zhì)體小，易于通過血管內(nèi)皮間隙。其中PEI正電荷密度高，轉(zhuǎn)染能力較強［9］，故在多種細(xì)胞中被廣泛應(yīng)用;但同時其表面電荷太大，易引起細(xì)胞膜破裂而導(dǎo)致細(xì)胞毒性很大，因此其臨床應(yīng)用受到很大限制。IONP是一種水溶性的、表面有羧基的氧化鐵納米粒子;具有很好的生物相容性和可降解性，在體內(nèi)可作為靶向的磁共振顯像試劑，并且能夠通過化學(xué)鍵與一些抗腫瘤藥物連接，把化療藥物帶到細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到向腫瘤細(xì)胞輸送藥物的功能;還可以用作細(xì)胞分離、熱療以及磁傳感器等［10-13］。

本實驗中，利用IONP表面的負(fù)電荷部分中和PEI表面的正電荷，即減小PEI對細(xì)胞的毒性;也能夠為后續(xù)連接化療藥物的實驗提供納米載體。目前研究的基因載體具有很高轉(zhuǎn)染效率的同時，卻缺乏了將siRNA靶向運送到腫瘤細(xì)胞的功能。人源性單鏈片段抗體可以與納米微粒體或多肽重組成融合蛋白，便于攜帶基因物質(zhì)，可考慮用作RNAi藥物選擇性投遞的向?qū)В?4］，并且其與輸送載體結(jié)合，可構(gòu)建出高效、低毒和向腫瘤細(xì)胞靶向輸送基因的載體［15］。本課題組在前期研究中已經(jīng)合成并驗證了針對腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的CD44v6黏附分子的單鏈抗體——scFvCD44v6。CD44v6在胰腺癌中的表達(dá)明顯高于周圍正常的胰腺組織和慢性胰腺炎組織，scFvCD44v6能夠特異性地識別CD44v6表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞［4］。本實驗中，將scFvCD44v6與PEI復(fù)合，形成具有腫瘤細(xì)胞靶向的載 體——scFv-IONP-PEI。實 驗結(jié) 果 表明，scFvCD44v6不僅能成功地與IONP-PEI偶聯(lián)，而且能將更多的siRNA帶到細(xì)胞中。熒光顯微鏡觀察，scFv靶向組顯示比非靶向組更強的紅光，流式轉(zhuǎn)染率結(jié)果進(jìn)一步驗證了這點，靶向組的轉(zhuǎn)染率達(dá)到了(89.75±1.81)%，明顯地高于非靶向組。為了進(jìn)一步驗證scFvCD44v6的靶向作用，用FITC標(biāo)記的小鼠抗6×His tag單克隆抗體做細(xì)胞免疫熒光，在細(xì)胞膜上出現(xiàn)能夠特異識別CD44v6的綠色熒光，從而說明scFvCD44v6不僅能夠成功地與IONP-PEI復(fù)合，而且能將siRNA靶向地輸送到腫瘤細(xì)胞。IONP是一種含鐵的納米材料，在普魯士藍(lán)染色反應(yīng)中呈現(xiàn)藍(lán)色，結(jié)果顯示細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒，進(jìn)一步說明復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)。采用RT-PCR和Western blotting來驗證轉(zhuǎn)染效果，本實驗中選擇的靶基因是KRAS，Panc-1細(xì)胞是KRAS突變的細(xì)胞。結(jié)果表明，非靶向組和靶向組的KRAS mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組，并且靶向組的干擾效果明顯高于非靶向組;證明scFv-IONP-PEI能夠?qū)iRNA靶向輸送到腫瘤細(xì)胞，且起到更明顯的干擾作用。

相關(guān)研究表明，scFv-IONP-PEI不僅能夠向細(xì)胞輸送基因，還能夠通過IONP的化學(xué)基團(tuán)與化療藥物連接，達(dá)到同時向細(xì)胞輸送藥物和基因的兩種功能，并且IONP含有鐵原子，能夠作為磁共振增強的顯像試 劑［3］。因 此，scFvCD44v6靶 向 的 IONP-PEI，即scFvCD44v6-IONP-PEI，在載藥納米微粒治療腫瘤的研究中具有很好的應(yīng)用前景，是一種安全、高效的輸送siRNA的載體。

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