孟祥艷， 于海龍， 買 霞， 張文成， 徐瑞成

缺氧預(yù)處理(hypoxic preconditioning，HPC)是指機(jī)體在經(jīng)受輕度或中度的缺氧刺激后，對后續(xù)的嚴(yán)重刺激產(chǎn)生耐受性的一種生物學(xué)效應(yīng)［1］。預(yù)處理作為機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制之一，不僅可對抗在體器官的缺血/再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷，也可對抗離體細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧(hypoxia reoxygenation，H/R)損傷［2］。然而，HPC的心肌保護(hù)機(jī)理尚未完全闡明，HPC保護(hù)作用及其機(jī)制的研究對于臨床更好地預(yù)防和治療缺血/缺氧性心臟病具有重要意義。

ZFP580是本組克隆的一種新的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子，ZFP580廣泛存在于各種大鼠細(xì)胞內(nèi)，并在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量最高［3］。前期實(shí)驗(yàn)研究證明ZFP580可能參與維持細(xì)胞的正常功能，對細(xì)胞的存活和增殖等生理活動具有明顯意義［4-5］。在大鼠心肌I/R損傷研究中，L-精氨酸預(yù)處理可明顯上調(diào)大鼠心肌組織中ZFP580的表達(dá)并發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［6］。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察HPC對心肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用及鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580表達(dá)的改變，探討ZFP580的作用及相關(guān)的信號調(diào)控，為進(jìn)一步揭示HPC的心肌保護(hù)機(jī)制及ZFP580的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供;胎牛血清(Gibco);高糖 DMEM(Hy-Clone);ZFP580Ⅰ抗(Abcam);β-actinⅠ抗(Sigma);CK-MB含量ELISA檢測試劑盒(R＆D);LDH活力生化檢測試劑盒(南京建成);Annexin V-PE/7-AAD染色試劑(Invitrogen);其余試劑為國產(chǎn)分析純。模擬缺血的缺氧培養(yǎng)基配方(mmol/L，pH 6.2):1.0 KH2PO4，10.0 NaHCO3，1.2 MgCl2·6H2O，25.0 HEPES，74.0 NaCl，16.0 KCl，1.2 CaCl2，20.0 Na lactate。

2 方法

2.1 H9c2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞于含有10%胎牛血清的高糖DMEM、37℃恒溫培養(yǎng)箱(5%CO2)中培養(yǎng)，隔天換液，3 d傳代1次，各組細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前8～12 h利用無血清DMEM饑餓使細(xì)胞同步化。

2.2 缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為:(1)缺氧/復(fù)氧(H/R)組:H9c2心肌細(xì)胞換用缺氧培養(yǎng)基(預(yù)先用氮?dú)怙柡?0 min)后，置入缺氧裝置后密閉。然后從進(jìn)氣口充入混合氣(95%N2+5%CO2)，持續(xù)通氣3 h后，將細(xì)胞換用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，實(shí)現(xiàn)復(fù)氧;(2)缺氧預(yù)處理(HPC)組:將心肌細(xì)胞用D-Hanks液洗1次后加入無血清高糖DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于95%N2+5%CO2平衡的低氧密閉容器中，37℃低氧10 min，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱(含濕潤的95%air+5%CO2)復(fù)氧20 min，重復(fù)該步驟3次后進(jìn)行H/R實(shí)驗(yàn);(3)對照(control)組:細(xì)胞換用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)5 h。

2.3 MTT染色及LDH水平測定 接種于96孔板的H9c2心肌細(xì)胞分別進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組處理后，每孔加入 10 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，每孔加入100 μL DMSO后低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值(A)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A/正常對照組A×100%。LDH的測定:收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基后離心取上清，按照LDH活性生化檢測試劑盒說明進(jìn)行檢測。

2.4 阻斷ERK的研究 H9c2心肌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓12 h后，在培養(yǎng)基中加入ERK阻滯劑PD98059(預(yù)先溶解于 DMSO中)，終濃度為 10 μmol/L。同時(shí)設(shè)DMSO對照組，即在培養(yǎng)基中加入等量DMSO。2組細(xì)胞在PD98059或等量DMSO預(yù)處理1 h后，均進(jìn)行H/R實(shí)驗(yàn)，經(jīng)Western blotting觀察ZFP580的表達(dá)情況。

2.5 慢病毒介導(dǎo)的ZFP580基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 按照劉彬等［7］的方法，分別重組表達(dá) ZFP580全長基因(Lenti-ZFP580)或針對ZFP580的siRNA(Lenti-siRNA)的慢病毒載體，并設(shè)空載體(Lenti-NC)的陰性對照，其中，載體構(gòu)建、慢病毒包裝及滴度檢測均由吉瑪公司(上海)完成。按照感染復(fù)數(shù)(MOI值)200將稀釋好的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中感染H9c2心肌細(xì)胞，即每1×105細(xì)胞約加入病毒液(滴度為1012TU/L)20 μL，并添加 polybrene(5 mg/L)提高感染效率。慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)在H9c2心肌細(xì)胞H/R實(shí)驗(yàn)前72 h進(jìn)行。

2.6 Annexin V-PE/7-AAD染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測H9c2細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞術(shù)以Annexin V-PE/7-AAD染色法檢測H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況。各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，調(diào)整濃度至1×106cells/L，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后分別用PE標(biāo)記的Annexin V和7-AAD進(jìn)行染色，隨后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)及分析。細(xì)胞早期凋亡時(shí)，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)并與Annexin V結(jié)合;細(xì)胞晚期凋亡時(shí)，細(xì)胞膜已不完整，7-AAD能夠透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞核染紅。據(jù)此原理，Annexin V與7-AAD染色可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選計(jì)數(shù)。

2.7 Western blotting 檢測 ZFP580、ERK1/2 和caspase-3的表達(dá) 提取各實(shí)驗(yàn)組H9c2心肌細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，將樣品與SDS凝膠加樣緩沖液混合，煮沸10 min使蛋白變性。取60 μg總蛋白上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)，室溫?fù)u床上孵育2 h，充分漂洗后按ECL發(fā)光試劑盒說明書操作，曝光后X光片用凝膠圖像分析軟件掃描，測定蛋白條帶的灰度值。ZFP580、caspase-3表達(dá)結(jié)果用實(shí)測灰度值與內(nèi)參照 β-actin的比值表示，ERK1/2磷酸化程度用p-ERK1/2與總ERK1/2的比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 11.0軟件處理。樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1H PC對H/R處理后MTT染色和LDH活性的影響

H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，細(xì)胞存活率降低，漏出至培養(yǎng)基的LDH活性增加(均P＜0.05)，HPC能顯著升高細(xì)胞存活率和降低培養(yǎng)基中LDH活性，與H/R組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖 1。

Figure 1.Effects of HPC on viability(MTT assay;A)and LDH leakage(B)of the H9c2 cells subjected to H/R injury.Mean±SD.n=6.*P ＜0.05 vs control(no treatment);#P ＜0.05 vs H/R.圖1 HPC對H/R處理后細(xì)胞存活率和LDH活性的影響

2 HPC對H/R處理后心肌細(xì)胞中ZFP580及ERK1/2表達(dá)的影響

經(jīng)H/R處理后，H9c2心肌細(xì)胞中ZFP580表達(dá)及ERK1/2磷酸化程度明顯上調(diào)(均P＜0.05)，而HPC組心肌細(xì)胞中ZFP580表達(dá)及ERK1/2磷酸化程度較H/R處理后上升更加明顯，與H/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effects of HPC on ZFP580 expression(A)and ERK1/2 phosphorylation(B)in the H9c2 cells.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control(no treatment);#P＜0.05 vs H/R.圖2 HPC對H/R處理后心肌細(xì)胞中ZFP580表達(dá)及ERK1/2磷酸化的影響

3 PD98059對HPC處理后ZFP580表達(dá)的影響

H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)PD98059預(yù)處理1 h后進(jìn)行HPC及 H/R實(shí)驗(yàn)，Western blotting結(jié)果顯示PD98059預(yù)處理明顯抑制HPC誘導(dǎo)的ZFP580的表達(dá)上調(diào)，而DMSO對照組細(xì)胞ZFP580在HPC及H/R后表達(dá)未受影響，見圖3。

4 慢病毒介導(dǎo)ZFP580基因轉(zhuǎn)染對H/R處理后caspase-3表達(dá)的影響

經(jīng)Western blotting方法驗(yàn)證，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染能明顯改變H9c2心肌細(xì)胞中ZFP580的表達(dá)水平，見圖4A。轉(zhuǎn)染Lenti-ZFP580使ZFP580高表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在H/R損傷后，心肌細(xì)胞中活化caspase-3表達(dá)下降，明顯低于轉(zhuǎn)染Lenti-NC的陰性對照組。轉(zhuǎn)染Lenti-siRNA使ZFP580低表達(dá)或不表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在H/R損傷后，心肌細(xì)胞中活化caspase-3表達(dá)上升，明顯高于ZFP580高表達(dá)組及陰性對照組，見圖4B。

Figure 3.Effects of PD98059 on HPC-induced ZFP580 expression.Mean ± SD.n=6.*P ＜ 0.05 vs DMSO alone;#P ＜0.05 vs HPC+H/R+DMSO.圖3 PD98059對HPC處理后ZFP580表達(dá)的影響

Figure 4.Lentivirus-mediated transfection of ZFP580(A)affected H/R-induced caspase-3 activation(B)in H9c2 cells.Mean±SD.n=6.*P ＜0.05 vs Lenti-NC group.圖4 慢病毒介導(dǎo)的ZFP580基因轉(zhuǎn)染對H/R處理后caspase-3表達(dá)的影響

5 Annexin V-PE/7-AAD染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染不同慢病毒載體的H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，流式細(xì)胞儀均可檢測到凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Lenti-ZFP580后高表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在H/R損傷后細(xì)胞凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染Lenti-NC的陰性對照組，轉(zhuǎn)染 Lenti-siRNA后低表達(dá)或不表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在H/R損傷后細(xì)胞凋亡率升高，明顯高于ZFP580高表達(dá)組及陰性對照組，見圖5。

討 論

Figure 5.The results of Annexin V-PE/7-AAD staining and flow cytometry quantification.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs Lenti-NC group.圖5 Annexin V-PE/7-AAD染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

缺氧預(yù)處理能增強(qiáng)機(jī)體對缺血、缺氧、缺血/再灌注等損傷的耐受性，然而其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明。有研究認(rèn)為HPC的保護(hù)機(jī)制與其引起的大量內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放有關(guān)，如腺苷、氧自由基清除酶、緩激肽及多種保護(hù)蛋白均被證實(shí)參與了HPC的保護(hù)作用［8-9］。然而，從細(xì)胞感受細(xì)胞外的缺氧信號，并將信號傳至胞內(nèi)，最終引起內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放，其中必然存在復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。近年研究發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 1/2，MAPK)家族是聯(lián)系細(xì)胞膜表面信號與決定性基因表達(dá)之間的重要信號調(diào)節(jié)酶之一，對缺血、缺氧等刺激均可作出不同的反應(yīng)，控制著細(xì)胞的適應(yīng)、增殖、分化、存活和死亡等過程［10］。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)是MAPK家族成員之一。離體心肌I/R模型缺血15 min后再灌注5 min，心肌細(xì)胞中ERK活性增加，另有研究表明短時(shí)缺氧后的復(fù)氧也可使心肌細(xì)胞中的ERK激活［11-12］。同時(shí)大量研究證實(shí)，作為聯(lián)系細(xì)胞漿與細(xì)胞核之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使，ERK參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在心肌I/R損傷中發(fā)揮了心肌細(xì)胞保護(hù)作用［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HPC的心肌細(xì)胞在H/R后的細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞存活率升高，驗(yàn)證了文獻(xiàn)報(bào)道的HPC的細(xì)胞保護(hù)作用。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞在H/R后ZFP580表達(dá)增加而HPC可引起ZFP580表達(dá)的進(jìn)一步上調(diào)，并且心肌細(xì)胞中ZFP580表達(dá)上調(diào)和ERK1/2磷酸化的水平升高趨勢相一致。由此，我們設(shè)想，H/R誘導(dǎo)的ZFP580表達(dá)上調(diào)是否如ERK的激活一樣參與了心肌細(xì)胞自身的抗損傷反應(yīng)?另外，作為核轉(zhuǎn)錄因子，H/R誘導(dǎo)的ZFP580表達(dá)上調(diào)是否受到ERK1/2通路的調(diào)控?通過應(yīng)用ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑 PD98059發(fā)現(xiàn)，PD98059預(yù)處理能明顯抑制HPC后心肌細(xì)胞中ZFP580的表達(dá)上調(diào)?？梢姡琀PC引起的ZFP580表達(dá)上調(diào)和ERK1/2磷酸化有關(guān)，ZFP580作為ERK1/2途徑調(diào)控的下游靶點(diǎn)在HPC保護(hù)心肌細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用。

細(xì)胞凋亡是指觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)死亡程序而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程。研究認(rèn)為，心肌缺血主要導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死，而再灌注則加速細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡是再灌注后引起心肌細(xì)胞死亡的主要形式［14］。據(jù)此，抗凋亡作用或特異性影響凋亡相關(guān)信號通路成為I/R損傷后保護(hù)心肌的有效措施之一。Li等［15］在心肌I/R模型中發(fā)現(xiàn)，激活ERK后再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡減少，阻斷ERK通路可增加心肌細(xì)胞的凋亡。盡管ERK1/2抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚未完全闡明，然而現(xiàn)有研究表明，ERK1/2被激活后通過誘導(dǎo)下游靶分子的活化來發(fā)揮心臟保護(hù)作用。其中轉(zhuǎn)錄因子Egr-1(early growth response gene-1)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶等下游靶分子均被證實(shí)參與了ERK1/2通路的抗凋亡作用［16］。為了證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子ZFP580在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用，我們利用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得了高/低表達(dá)ZFP580的H9c2細(xì)胞，并進(jìn)行H/R損傷實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZFP580高表達(dá)明顯抑制H/R損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞中caspase-3的活化，可見ZFP580通過抑制caspase-3的活化實(shí)現(xiàn)了抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過建立HPC及H/R損傷的細(xì)胞模型，證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子ZFP580作為ERK1/2信號通路的下游靶分子之一，具有抗細(xì)胞凋亡的作用。據(jù)此，我們推斷HPC誘導(dǎo)的ZFP580表達(dá)上調(diào)作為內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制之一介導(dǎo)了HPC的細(xì)胞保護(hù)作用，然而ZFP580調(diào)控的下游靶基因及其參與細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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