陳曉華，余小艷，周潔，姜威，胡俊，鐘山 ，楊國華

耳聾出生缺陷是影響我國出生人口素質(zhì)的重要問題之一[1]，2006年12月第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，耳聾位居我國各類殘疾之首，聽力殘疾者高達(dá)2780萬，且每年以3萬聾兒的新發(fā)速度在增長[2]，約60%的先天性耳聾由遺傳性因素導(dǎo)致[3]。非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing impairment，NSHI)占遺傳性耳聾的70%，約77%的NSHI為常染色體隱性遺傳[4-5]?？p隙連接蛋白2(gap junction protein beta-2，GJB2)基因突變是常染色體隱性遺傳聽力損失的主要原因之一[6]，約有50%的常染色體隱性遺傳NSHI患者存在該基因突變[7]。目前已知的與耳聾有關(guān)的GJB2基因突變位點(diǎn)有100多個(gè)，其中235delC突變在東亞人群發(fā)生頻率較高[8]。在耳聾基因診斷的臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)同時(shí)攜帶GJB2 235delC和176-191del16bp的家系，對此家系相關(guān)成員的基因型進(jìn)行了分析，并對孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

1 資料與方法

1.1 研究對象 樣本取自湖北孝感市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科。孕婦(Ι-2)33歲，身體健康，受檢時(shí)妊娠20周，孕期常規(guī)體檢未見異常，其第一胎為先證者(Ⅱ-1)，男，7歲，漢族，智力正常，出生后即無聽力、無語言能力，心、腦、腎等器官無異常。孕婦丈夫(Ι-1)32歲，身體健康。夫婦二人已育有一子，即為耳聾先證者(Ⅱ-1)，第二胎(Ⅱ-2)胎齡20周，家系譜見圖1。

圖1 患者家系圖Fig. 1 Pedigree of the non-syndromic deafness family

1.2 研究方法

1.2.1 臨床聽力學(xué)檢測 對先證者進(jìn)行電耳鏡檢查、純音測聽、聲導(dǎo)抗檢測及顳骨CT掃描檢查。以2003年《關(guān)于非綜合征型遺傳性聽損傷家系遺傳學(xué)及聽力學(xué)描述術(shù)語建議案》為耳聾診斷標(biāo)準(zhǔn)，耳聾程度按照兩耳中聽力較好耳的平均聽閾(0.5～4.0kHz聽閾的平均值)來評估： ≤20dB HL為正常；20～40dB HL為輕度聽力損失；41～70dB HL為中度聽力損失；71～95dB HL為重度聽力損失；＞95dB HL為極重度聽力損失。

1.2.2 家系所有成員GJB2基因型測序及比對

1.2.2.1 基因組DNA抽提 取得該家系成員書面同意后，抽取該家系成員Ι-1、Ι-2、Ⅱ-1外周抗凝血各2ml，應(yīng)用蛋白酶K法提取白細(xì)胞基因組DNA；超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取孕婦羊水20ml，無菌培養(yǎng)羊水細(xì)胞1周后，應(yīng)用蛋白酶K法提取羊水細(xì)胞基因組DNA。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA定量與純度分析，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增GJB2基因 通過NCBI GenBank查詢到GJB2編碼區(qū)序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物：5'-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3'，下游引物：5'-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3'，產(chǎn)物大小為960bp。應(yīng)用ABI 9700熱循環(huán)儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μl，dNTP 2.5μl，Taq酶2μl，10μmol/L上下游引物各1 μl，100ng DNA模版1 μl，ddH2O 15μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延長10min。對擴(kuò)增后產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳粗測，結(jié)果顯示家系中所有成員均含有GJB2基因(圖2)。

圖2 家系各成員GJB2基因PCR電泳圖Fig.2 GJB2 electrophoresis analysis of the family members

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物測序及TA克隆后測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行純化，送上海生工(Sangon)生物工程股份有限公司測序。采用上、下游引物雙向測序證實(shí)的序列變異認(rèn)定為突變。針對測序圖出現(xiàn)的難辨雜峰，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆后再挑取單克隆進(jìn)行測序：將PCR純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMDI8-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，每一產(chǎn)物挑取多個(gè)克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌液，抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序。在多個(gè)克隆中同時(shí)存在的序列變異認(rèn)定為突變。

1.3 序列比對 應(yīng)用Bioedit軟件將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站提供的人類GJB2基因標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank：AY280971.1；GI:33391196)進(jìn)行比對。利用Omiga 2.0軟件對核酸序列進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 聽力學(xué)檢測結(jié)果 純音電測聽檢查結(jié)果顯示，先證者左右耳聽力均大于71分貝，屬于重度耳聾。其聲阻抗檢查與純音電測聽檢查結(jié)果相符。顳骨CT顯示內(nèi)耳結(jié)構(gòu)及發(fā)育均無異常。全身檢查無其他系統(tǒng)異常，排除內(nèi)耳及神經(jīng)的占位病變。第二胎出生后住院期間聽力篩查雙耳通過，至今已10月齡，隨訪聽力完全正常。

2.2 家系所有成員GJB2基因型測序及比對結(jié)果由圖3、4可見，測序結(jié)果顯示父親攜帶GJB2 176-191del16雜合突變，母親攜帶GJB2 235delC雜合突變。先證者分別遺傳了父母有突變的一條染色體，即同時(shí)攜帶235delC與176-191del16的復(fù)合突變，因此屬于GJB2復(fù)合突變引起的常染色體隱性遺傳耳聾。因其父母均為攜帶者，再生育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)為25%。胎兒遺傳了母親有突變的第13號染色體，攜帶GJB2 235delC雜合突變，即一條染色體為GJB2 235delC，而另一條染色體正常，因此，僅為GJB2 235delC雜合突變攜帶者，發(fā)生耳聾的風(fēng)險(xiǎn)與正常人群相近，不同于先證者的基因型，不會復(fù)制先證者的聽力結(jié)構(gòu)。

圖3 先證者突變型測序圖Fig.3 Sequencing results of the mutant of the proband

圖4 家系各成員GJB2 DNA序列比對Fig.4 GJB2 DNA sequence alignment of the family

3 討 論

GJB2突變所致的耳聾主要為先天性NSHI，為常染色體隱性遺傳模式。在中國人群中，已檢出由GJB2突變所致的兒童語前聾達(dá)到26%，占常染色體隱性遺傳性耳聾的28%[9-10]。世界不同地區(qū)的耳聾家系中均檢測到GJB2基因突變[11-17]，其中重度耳聾新生兒的發(fā)病率達(dá)1/800～1/1000[2,18]。近期對不同年齡段NSHI常見基因進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，GJB2基因突變患者的發(fā)病年齡集中在1歲以內(nèi)，所占比例高達(dá)66.67%[19]。由于兒童NSHI無其他組織器官異常表現(xiàn)，因此很難及時(shí)篩查和早期干預(yù)[20]。本文家系父母均為聽覺正常的GJB2突變攜帶者，先證者同時(shí)攜帶父親的176-191del16bp和母親的235delC突變，出生即耳聾并喪失語言能力。胎兒基因檢測結(jié)果為GJB2基因235delC雜合突變，來源于其母親，因此胎兒為GJB2 235delC雜合突變攜帶者，耳聾風(fēng)險(xiǎn)與正常人群接近。后隨訪證實(shí)，該胎兒出生后通過雙耳聽力篩查，至今已10月齡，聽力完全正常。夫婦兩人為同一基因(GJB2)致病突變攜帶者，這類耳聾家庭在臨床中所占比例相對較小，但一旦發(fā)生，其孕育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)將大幅提高。因此，必須注重與普及婚育前耳聾基因普遍性篩查，做好產(chǎn)前診斷及干預(yù)。

GJB2基因編碼分子量為26.5kD的縫隙連接蛋白26(Connexin26，Cx26)，定位于染色體13q11-12，基因組DNA全長4804kb，含有2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子，其編碼區(qū)位于第2外顯子[21]。Cx26主要分布于內(nèi)耳的血管紋、螺旋韌帶、螺旋緣及耳蝸的支持細(xì)胞之間，與相鄰細(xì)胞的間隙連接蛋白組成間隙連接通道，維持耳蝸中細(xì)胞間信息的正常傳遞和K+的正常循環(huán)，保證耳蝸聽覺系統(tǒng)的正常功能[22-24]。GJB2基因發(fā)生突變可導(dǎo)致Cx26蛋白結(jié)構(gòu)異常，縫隙連接缺損，通道不能正常開閉，使細(xì)胞間信號傳遞受阻或紊亂，從而引起感音神經(jīng)性耳聾[21,25]。在我國，GJB2 235delC是NSHI患者的主要突變方式[16,26]，對先天性耳聾患者進(jìn)行突變篩查發(fā)現(xiàn)，GJB2 235delC突變在先天性耳聾患者中所占比例為18.16%[27]。235delC突變位于Cx26蛋白第二跨膜區(qū)，引起第79位密碼子移碼突變，導(dǎo)致終止密碼子提前至第82位，使所編碼的多肽只有81個(gè)氨基酸，比野生型蛋白截短了145個(gè)氨基酸，造成其間隙連接功能失活，產(chǎn)生了一個(gè)無功能的縫隙連接蛋白[28]。176-191del16bp突變是NSHI人群GJB2基因中僅次于235delC突變的另一種突變形式[29]，可導(dǎo)致密碼子59－76的移碼改變，使終止密碼子提前，產(chǎn)生無功能蛋白，使K+經(jīng)內(nèi)耳毛細(xì)胞循環(huán)回流進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴液的循環(huán)受到影響，最終導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。該家系在分子水平上驗(yàn)證了攜帶GJB2基因突變的耳聾為先天性耳聾的特點(diǎn)，提示在臨床上進(jìn)行耳聾患者GJB2基因診斷時(shí)，應(yīng)將235delC和176-191del16突變列為耳聾基因檢測的常規(guī)項(xiàng)目。

GJB2基因突變所致的耳聾大多數(shù)為隱性遺傳，其系譜特點(diǎn)為：①患者的雙親表現(xiàn)型往往正常，但他們均為致病基因攜帶者，出生耳聾患兒的可能性約占1/4，患兒的正常同胞中有2/3的可能性為攜帶者；②系譜中看不到連續(xù)傳遞，即表現(xiàn)為散發(fā)病例，往往在整個(gè)系譜中只有先證者1例患者；③性狀的遺傳與性別無關(guān)；④近親婚配時(shí)，后代中發(fā)病率明顯增高。因此，在產(chǎn)前診斷中，如果發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶2個(gè)GJB2基因的致病突變位點(diǎn)，則其發(fā)生耳聾的概率為100%。我們將家系的分析結(jié)果用于先證者家庭的產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷，避免了該家庭再次生育突變基因型的兒童。在我國的NSHI患者中，明確為GJB2基因突變引起耳聾的比例達(dá)到21.01%[29]。因此對GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的家庭進(jìn)行遺傳咨詢、產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。

耳聾產(chǎn)前診斷應(yīng)盡可能在孕早期進(jìn)行，早期得到診斷結(jié)果，早期進(jìn)行生育選擇，避免痛苦較大的中后期引產(chǎn)。此外，母親最好提前進(jìn)行遺傳咨詢，在耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)以及致聾基因型確定之后再懷孕，以免造成不良后果[30]。此例家庭的胎兒只攜帶了來自母親的235delC雜合突變，未導(dǎo)致聽力異常是幸運(yùn)的，但懷孕前未進(jìn)行遺傳咨詢或檢查時(shí)間較晚則不可取。接受產(chǎn)前診斷時(shí)，應(yīng)根據(jù)母親妊娠的不同時(shí)期選擇適當(dāng)?shù)娜〔姆椒?，妊?1～13周時(shí)行絨毛膜取樣，妊娠16～22周時(shí)行超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺羊水取樣，妊娠22～37周時(shí)行超聲引導(dǎo)下的臍帶穿刺取血(妊娠13～16周時(shí)暫不取材)。因此筆者建議，如發(fā)現(xiàn)有耳聾先證者，先確定其耳聾病因；在進(jìn)行了基因突變分析和詳盡的遺傳咨詢后，再決定其家系成員是否受孕和接受產(chǎn)前診斷。只有這樣，才能真正達(dá)到產(chǎn)前診斷目的，從而有效阻斷耳聾在這一高危人群中的傳遞。

我國每年新生聾兒約3萬例，耳聾的基因篩查和產(chǎn)前診斷依然面臨艱巨的任務(wù)和挑戰(zhàn)。隨著新一代測序技術(shù)的應(yīng)用，新的耳聾基因?qū)⒉粩啾话l(fā)現(xiàn)和鑒定，這為臨床遺傳性耳聾的基因診斷提供了新的候選位點(diǎn)，也為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了新的依據(jù)，有助于進(jìn)一步降低出生缺陷。

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