許代福，方應權

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶萬州 404020)

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，具有調經(jīng)止痛，活血補血的功效［1］。大葉當歸(A.megaphylla)是我國特有的傘形科當歸屬植物，分布于四川等地，在三峽庫區(qū)的巫溪、巴東、石柱和巫山等地區(qū)尤為常見，當?shù)孛耖g常用作當歸的代用品。本品含有與正品當歸相同的藁本內酯、揮發(fā)油、阿魏酸等活性成分［2-3］。阿魏酸 (ferulic acid)作為大葉當歸的主要活性成分之一，具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗心肌缺血、抗氧化，抗癌等作用。此外，阿魏酸在食品、醫(yī)藥、化妝品及添加劑等領域均有廣泛的用途［4-6］。阿魏酸的傳統(tǒng)提取方法包括滲漉法［7］、乙醇回流法［8］和超聲提取法［9］等。這些方法存在能量消耗大、所需溶劑多，操作時間長等缺點?，F(xiàn)代提取方法如超臨界CO2萃取法［7］、加速溶劑萃取法［10］以及微波輔助提取法［11］等用于提取當歸中的阿魏酸也已見文獻報道，但這些方法也存在設備成本高，能耗大等缺點。

閃式提取法，又名組織破碎提取法，是近年來發(fā)展起來的一種新型提取技術，具有高效、迅速和節(jié)能等優(yōu)點［12-13］，該方法利用高速剪切力和超分子滲濾技術在短時間內將藥材粉碎至細微顆粒，使藥材中有效成分迅速達到溶解平衡，從而實現(xiàn)高效提取。本實驗首次采用實驗設計結合響應面法優(yōu)選閃提法提取大葉當歸中阿魏酸的工藝條件，并與傳統(tǒng)的提取方法進行比較。

1 儀器與材料

Agilent 1200系列高效液相色譜儀，Agilent ChemStation B.04.02工作站 (美國安捷倫公司);JHBE-50S型中草藥閃式提取器 (河南金鼎科技發(fā)展有限公司);RE 52-86A旋轉蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);Millipore simplicity-185超純水器 (美國密里博公司);Sartorius BS110S分析天平(北京賽多利天平有限公司)。

大葉當歸，采自巫溪大寧河畔1500米高山上，由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為A.megaphylla的根。阿魏酸對照品 (中國食品藥品檢定研究院提供，批號110773-200611);甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 大葉當歸中阿魏酸測定方法 參考文獻［1，14］，測定大葉當歸中阿魏酸的量。色譜條件為:安捷倫 SB C18高效液相色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水-磷酸 (30∶70∶0.3)為流動相;檢測波長為316 nm;體積流量為1.0 mL/min;柱溫35℃;進樣量20 μL;在1.98～99.00 μg/mL范圍內阿魏酸質量濃度與峰面積呈線性關系(r=0.9999);精密度RSD＜0.96%;平均加樣回收率為97.26%，RSD為1.75%。

2.2 實驗設計

2.2.1 考察因素和水平的確定 參考相關文獻報道及前期預試驗結果［9-11，15］，采用甲醇或乙醇提取當歸中阿魏酸的效果較好，考慮安全因素，本研究選用乙醇為溶劑，并保持粉末粒徑為粗粉，閃提工作電壓120V，考察乙醇體積分數(shù)、乙醇體積 (液料比)和提取時間對提取得率的影響。

取干燥大葉當歸根莖，干燥，制成粗粉 (20目)，稱取20 g，進行閃式提取，提取完成后過濾提取液，濾液加70%甲醇-鹽酸 (100∶1)稀釋至500 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇-鹽酸 (100∶1)補足質量，搖勻，靜置，取上清液，以0.45 μm孔徑濾膜濾過，按“2.1”項測定阿魏酸的含有量，以阿魏酸得率作為考察指標，采用單因素法考察乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間對閃式提取的影響。結果顯示，當15倍量 (v/m)65%乙醇提取時間80 s時，閃式提取大葉當歸中阿魏酸得率較高。

2.2.2 Box-Behnken實驗設計及響應面分析 選取影響閃式提取工藝的三個因素，即乙醇體積分數(shù) (x1)，乙醇體積倍數(shù) (x2)，提取時間 (x3)為考察因素，以阿魏酸得率(Y)為響應值，進行Box-Behnken試驗，各因素取3水平，分別記為－，0，+，各因素和水平編碼及實際值見表1，實驗方案及結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

表2 Box-Behnken試驗結果

采用 Design Expert 7.0.0(Stat-Ease Inc.Minneapolis)軟件對表2中不同試驗條件下所得到的阿魏酸收率進行回歸分析，得擬合方程:

其中Y為響應值，βi代表不同的回歸系數(shù)，應用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 7.0.0對數(shù)據(jù)進行多元回歸和方差分析，結果如表3所示。

表3 Box-Behnken實驗設計方差分析

可見考察因素與響應值之間呈二次二項式模型，該模型呈現(xiàn)統(tǒng)計學極顯著意義 (P=0.001)。因素x1、x2和x3對響應值 (得率)均具有顯著影響;各因素交互作用項中，乙醇倍數(shù) (x2)與提取時間 (x3)的交互作用對阿魏酸得率的影響呈現(xiàn)統(tǒng)計學顯著意義，其它交互作用項的作用不顯著;各因素的二次項對響應值都具有顯著性影響。為簡化方程求解，在保證擬合度的前提下，進行了相應的方程簡化，在P＜0.1水平上拒絕無顯著相關的項目后，響應值與試驗因素的擬合方程為:

上述方程中，模型P＜0.001，表明建立的模型具有極顯著意義，校正決定系數(shù) (Adj.R2)為0.9816，說明該方程擬合程度好。模型失擬值 (lack of fit)檢驗結果為:F值為3.09，P=0.2625，即模型失擬不具有統(tǒng)計學顯著意義［16］。各因素與響應值的3D響應面和等高線圖見圖1。劑消耗的綜合作用，其公式如下:

圖1 乙醇體積分數(shù)、乙醇體積和提取時間對阿魏酸提取得率作用的響應面 (3D)和等高線圖

其中，pi為響應值的權重;n為響應值的數(shù)目;di為單個響應值的渴求函數(shù)。D值在0～1之間，D值越接近1則說明所確定的最優(yōu)條件越接近全局最優(yōu)條件。本研究設響應值目標為:得率最高，溶劑消耗最少，其中以得率為主要目標，因此本實驗阿魏酸得率權重取10，乙醇體積分數(shù)和乙醇體積倍數(shù)權重均取1。利用Design-Expert軟件整合渴求函數(shù)的計算功能，得最大化總體渴求值 (D)為0.796，因素的最佳水平組合為:乙醇64%，體積為藥材13倍(v/m)，提取時間100 s。在此工藝條件下，根據(jù)模型預測阿魏酸得率為0.0299%。

為驗證優(yōu)選工藝的可靠性和模型的預測性，取大葉當歸30 g，按最優(yōu)工藝進行閃式提取，平行操作3份，按“2.1”項下測定，阿魏酸得率均值為0.0292%，RSD為1.20%，與模型預測值的偏差為－2.31%。表明該工藝穩(wěn)定可行，具可操作性和重復性，且模型預測性好。

2.4 與其他提取方法的比較 根據(jù)文獻［7-9］，分別采用滲漉法、乙醇回流法和超聲提取法提取大葉當歸中的阿魏酸，每種方法重復3次，結果見表4。

表4 提取方法比較

3 討論

近年來，實驗設計 (design of experiment，DoE)結合響應面法 (response surface methodology，RSM)在中藥提取和制備中應用日益廣泛［17-18］。本研究在參考文獻和前期實驗的基礎上，通過實驗設計-響應面法，結合計算渴求函數(shù)值，得到了閃式提取大葉當歸中阿魏酸的最佳工藝條件，藥材制成粗粉 (20目)，以13倍 (m/V)的64%乙醇為提取溶劑，工作電壓120 V，提取時間100 s。該方法操作簡單穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，提取率較高。

比較閃式提取法和傳統(tǒng)提取方法可見 (表4)，乙醇回流法得率高，但液料比也高，閃提法和超聲輔助提取法的溶劑消耗量比較接近，為乙醇回流法的一半左右，得率分別為乙醇回流法的92.1%和89.9%。滲漉法溶劑消耗最少，但提取前需要浸泡2 d，因此操作時間最長，得率也相對較低。閃提法在提取時間上具有明顯優(yōu)勢，超聲輔助提取法、乙醇回流法和滲漉法所需時間分別是其30倍、108倍和2160倍。綜合考慮，閃提法不失為提取大葉當歸中阿魏酸的一種良好方法。

從實驗和文獻［9，12，14］中可以看到，大葉當歸中阿魏酸的含有量低于正品當歸，因此在使用上，可適當增大中藥的用量，以保證治療效果。而大葉當歸中其它有效成分的量也有待于進一步考察，以保證用藥安全。

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