張 霓，趙秀莉

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院，河南鄭州 450008)

清咽利膈丸是由射干、黃芩、連翹、梔子、熟大黃、牛蒡子、薄荷、天花粉、玄參、荊芥穗、防風(fēng)、桔梗、甘草十三味中藥組成的中藥成方制劑，具有清熱利咽、消腫止痛的功效、用于外感時(shí)毒、臟腑積熱、咽喉腫痛、胸膈不利、口苦舌干。由于組成復(fù)方的藥味較多，化學(xué)成分比較復(fù)雜，只采用單一或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。

目前，指紋圖譜已成為國內(nèi)外公認(rèn)的鑒別中藥品種和評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的最有效手段［1-8］。中藥指紋圖譜可以很好地表征中藥復(fù)方的整體情況，且已廣泛應(yīng)用于各種中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制［9-15］。本研究采用HPLC法建立清咽利膈丸的指紋圖譜，確定各共有峰的歸屬，并選取方中4種含有量較高且較穩(wěn)定的成分牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素同時(shí)測定，實(shí)現(xiàn)從多成分的系統(tǒng)化角度控制清咽利膈丸的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

日本島津LC－10A高效液相色譜儀，DAD檢測器;高速粉碎機(jī) (北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司);AL204電子天平 (梅特勒－托利多儀器有限公司);SB2200超聲儀 (上海必能超聲儀器公司)。

對(duì)照品黃芩苷 (110715-200212)、黃芩素(111595-200301)、漢黃芩素 (1514-200001)、牛蒡苷 (0819-9802)、次野鳶尾黃素 (557-200101)、對(duì)照藥材連翹 (120908-200613)、大黃 (121249-200402)、甘草 (120904-200511)均購自中國藥品與生物制品檢定所;清咽利膈丸10批 (批號(hào)5082001～5082010)均為北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn);甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相線性梯度洗脫 (0→60 min，30%→90%甲醇);體積流量1 mL/min;檢測波長278 nm;柱溫40℃;進(jìn)樣量10 μL;運(yùn)行時(shí)間 65 min。

2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成每1 mL含牛蒡苷0.12 mg、黃芩苷0.41 mg、黃芩素0.15 mg和漢黃芩素0.23 mg的混合對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo) Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取清咽利膈丸 (批號(hào)5082008)0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h點(diǎn)測定其指紋圖譜，以黃芩苷峰為內(nèi)參比峰，計(jì)算指紋圖譜中各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.41%，相對(duì)峰面積RSD為0.49%～2.97%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的線性關(guān)系測定Tab.1 Linearity of arctiin，baicalin，baicalein and wogonin

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取清咽利膈丸 (批號(hào)5082008)0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其指紋圖譜，以黃芩苷峰為內(nèi)參比峰，計(jì)算指紋圖譜中各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.57%，相對(duì)峰面積RSD為0.01% ～0.03%，精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取清咽利膈丸 (批號(hào)5082008)6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，測定其指紋圖譜，以黃芩苷峰為內(nèi)參比峰，計(jì)算指紋圖譜中各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.01%～0.36%，相對(duì)峰面積RSD為0.19%～2.92%，重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立和相似度計(jì)算 取10批清咽利膈丸，按供試品的制備方法處理、測定，運(yùn)用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件，建立清咽利膈丸指紋圖譜的共有模式，獲得了21個(gè)共有峰。以峰面積相對(duì)較大、較穩(wěn)定的黃芩苷作為參照峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值。以共有模式為參照，計(jì)算樣品與共有模式之間的相似度，結(jié)果見表2。10批樣品的色譜疊加圖見圖1。

表2 10批樣品指紋圖譜間的相似度結(jié)果Tab.2 Similarity results of ten batches of samples

圖1 10批清咽利膈丸的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of Qingyan Lige Pills of ten batches

2.5 清咽利膈丸樣品與各原料藥材的相關(guān)性及特征峰歸屬 按照供試品溶液制備方法，分別制備處方中各藥材供試品溶液，在清咽利膈丸指紋圖譜條件下分別測定與樣品相應(yīng)量各藥材的指紋圖譜，將獲得的樣品、藥材和相應(yīng)藥材的陰性色譜疊加、對(duì)比，從而確認(rèn)樣品指紋圖譜各特征峰的歸屬。結(jié)果樣品指紋圖譜中18個(gè)特征峰可以找到明確歸屬，它們分別來自黃芩、牛蒡子、甘草、防風(fēng)、射干、荊芥穗6味藥材。通過對(duì)照品試驗(yàn)，對(duì)比其保留時(shí)間和紫外光譜，共鑒別了其中6個(gè)指紋峰。分別為10號(hào)牛蒡苷，11號(hào)黃芩苷、17號(hào)黃芩素、18號(hào)次野鳶尾黃素和20號(hào)漢黃芩素。對(duì)照品和樣品的HPLC色譜圖見圖2。

圖2 供試品溶液、對(duì)照品溶液色譜圖 (278 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of Qingyan Lige Pills and reference substances(278 nm)

2.6 清咽利膈丸中4種成分的測定

2.6.1 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批清咽利膈丸樣品 (批號(hào)5082008)約0.25 g 6份，精密稱定，分別精密加入牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)照品適量，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件，測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.6.2 樣品測定 取清咽利膈丸樣品3批(5082001～5082003)，按照供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備方法，在清咽利膈丸指紋圖譜條件下同時(shí)測定清咽利膈丸中牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的量，結(jié)果見表4，色譜圖見圖3。

表4 3批樣品中牛蒡苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的測定結(jié)果Tab.4 Contents of arctiin，baicalin，baicalein and wogonin in three batches of samples

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 利用DAD檢測數(shù)據(jù)，對(duì)200～400 nm波段的指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)合色譜蜂個(gè)數(shù)和峰強(qiáng)度綜合考察。結(jié)果在278 nm下，色譜峰個(gè)數(shù)和峰強(qiáng)度達(dá)到最大，因此選擇278 nm作為檢測波長。

圖3 清咽利膈丸HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of Qingyan Lige Pills

3.2 流動(dòng)相的選擇 比較了等度洗脫和梯度洗脫，結(jié)果梯度洗脫對(duì)樣品的分離效果優(yōu)于等度洗脫。比較了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸四種溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明采用甲醇-磷酸系統(tǒng)樣品出峰最多且峰形最好，乙腈-磷酸系統(tǒng)雖洗脫能力強(qiáng)，運(yùn)行時(shí)間短，但峰數(shù)明顯少于甲醇-磷酸系統(tǒng)。對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了甲醇-0.2%磷酸線性梯度洗脫。

3.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇 在試驗(yàn)中考察了超聲、浸泡和加熱回流的提取方法，結(jié)果采用超聲的方法提取較完全。采用超聲提取法，考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇和乙醇的提取效率，結(jié)果表明用50%乙醇作為提取溶劑時(shí)，4種成分的量最高且峰形較好。又考察了50%乙醇超聲提取0.5、0.75、1、1.5、2 h后成分含有量差異，結(jié)果表明，超聲處理1 h可使樣品提取完全。

3.4 本研究建立了清咽利膈丸的高效液相色譜指紋圖譜，根據(jù)10批清咽利膈丸的指紋圖譜建立了共有模式，獲得了21個(gè)共有峰。通過與組成藥材和對(duì)照品的對(duì)比分析，確認(rèn)了指紋圖譜中18個(gè)特征峰在清咽利膈丸組成藥材中的來源。通過相似度分析，10批清咽利膈丸的相似度均大于0.99，表明樣品間質(zhì)量存在較好的一致性。本研究可為清咽利膈丸類似的復(fù)方制劑質(zhì)量控制研究提供思路。

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