賀鑫韜，馬桂芝，滕 亮，馬文娜（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830054）

帕金森?。≒arkinson′s disease）又稱“震顫麻痹”，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。美國神經(jīng)協(xié)會(huì)對各種抗帕金森病藥物進(jìn)行評估，結(jié)果表明，復(fù)方左旋多巴制劑（美多芭等）是所有帕金森病藥物治療中最有效的藥物［1］。但是該片劑使用方法繁瑣，給藥頻率高，中老年患者的用藥順應(yīng)性差，同時(shí)左旋多巴在十二指腸處有一個(gè)較窄的吸收窗，普通制劑由于胃滯留時(shí)間短，無法實(shí)現(xiàn)充分吸收，導(dǎo)致制劑生物利用度不理想。

胃漂浮給藥系統(tǒng)是依據(jù)流體動(dòng)力學(xué)平衡系統(tǒng)（hydrodynamcally balanced system，HBS）設(shè)計(jì)的在胃中密度小于胃內(nèi)容物密度（1.004～1.010g·cm－3）的給藥系統(tǒng)。由于制劑的密度小，口服后可漂浮在胃液上，使得藥物在胃腸道中總的釋放時(shí)間延長，增加了藥物在胃和十二指腸的吸收，降低毒副作用，提高了藥物的生物利用度［2］。微囊緩釋片是利用微囊技術(shù)制備緩釋單元，同時(shí)結(jié)合普通的壓片技術(shù)制備的新型緩釋制劑。微囊型緩釋制劑不僅具有普通緩釋制劑的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)利用刻痕壓片還可實(shí)現(xiàn)分劑量用藥。這是因?yàn)槠渥钚【忈寙卧獮槲⒛?，在分劑量使用過程中并不會(huì)破壞其緩釋結(jié)構(gòu)。

因此，課題組結(jié)合前期研究結(jié)果［3］，嘗試采用復(fù)合制劑技術(shù)將其研制成微囊胃漂浮片［4］，該微囊漂浮片具有緩釋、胃內(nèi)滯留以及可分劑量使用等特點(diǎn)，可以更好地滿足臨床用藥需求。本文在相關(guān)報(bào)道［5］的基礎(chǔ)上，建立了測定比格犬血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度的HPLC法，并對左旋多巴微囊胃漂浮片的藥物動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（WAT270944，美國Waters公司），熒光檢測器（Waters e 2695，美國Waters公司）；分析天平（BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司）；超低溫冰箱（DW－86L205，廣州傲雪低溫冰箱）；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（Exceed－Cd－16A，成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠）；超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機(jī)（LG10－2.4A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

1.2 試藥 左旋多巴對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100170－201003）；左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片（自制，批號(hào)20121120每片98mg）；高氯酸（分析純，上海桃浦化工廠，批號(hào)950420）；鹽酸（分析純，新疆燒堿廠，批號(hào)：02042052）；乙二胺四乙酸（EDTA，分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20080902）；磷酸二氫鉀（優(yōu)級(jí)純，天津新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號(hào)20050215）；庚烷磺酸鈉（色譜純，上海展云化工有限公司，批號(hào)1104017）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；水為超純水。

1.3 動(dòng)物 健康Beagle犬6只，雄性，體質(zhì)量12±1 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究部提供并飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（新）2010－0001。倫理委員會(huì)審批號(hào)：IACUC－20120523004。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ODS－1C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：水－甲醇（95∶5），其中水相含 EDTA 0.08mmol·L－1、磷酸二氫鉀70 mmol·L－1、庚烷磺酸鈉2.08mmol·L－1；流速：0.5 mL·min－1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL；激發(fā)波長：278nm，發(fā)射波長：325nm。

2.2 血漿樣品預(yù)處理 取比格犬全血2mL，4 200 r· min－1低溫（8℃）離心10min，取上層血漿，置于離心管中，加入等量60mL·L－1高氯酸溶液，渦旋振搖2min，沉淀蛋白，以10 000r·min－1離心15 min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后取20μL進(jìn)樣分析。

2.3 方法專屬性 在2.1項(xiàng)的色譜條件下，空白血漿、左旋多巴對照品、空白血漿加左旋多巴對照品、實(shí)際血漿樣品按2.2項(xiàng)下處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖（結(jié)果見圖1），由圖1可知，左旋多巴對照品保留時(shí)間約為8min，內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物與左旋多巴色譜峰基線分離，對左旋多巴的測定無干擾。

圖1 HPLC圖A.空白血漿；B.對照品溶液；C.空白血漿加左旋多巴對照品；D.給藥后1h血漿樣品；1.左旋多巴Fig.1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.reference solution；C.standard plasma；D.sample－after 1hadministration；1.levodopa

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取左旋多巴對照品0.005g，置于25mL量瓶中，用9mL·L－1的鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為左旋多巴儲(chǔ)備液（200 μg·mL－1）。取儲(chǔ)備液依次倍量稀釋成質(zhì)量濃度分別為200，100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56和0.78 μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別取空白血漿500 μL 9份，精密加入不同質(zhì)量濃度左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)液50μL，使血漿中左旋多巴的質(zhì)量濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.62，0.31，0.16 和 0.078μg·mL－1，按2.2項(xiàng)下依法操作，進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖。以待測物峰面積（Y）對左旋多巴質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝27 006.149 1 X＋479.768 7，r＝0.999 9（n＝8）。左旋多巴線性范圍為0.078～20 μg·mL－1，質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用信噪比法確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量下線為（LLOQ）0.078μg·mL－1（S／N≥10）。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿500μL，按2.5項(xiàng)下方法配制成左旋多巴低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（0.078，2.5和20μg·mL－1）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，連續(xù)測定3d，用隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的質(zhì)量濃度，測定日內(nèi)及日間的精密度，并與制備質(zhì)量濃度比較，求得方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，測定血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度的分析方法的精密度（RSD）與準(zhǔn)確度（RE）均在15%內(nèi)，符合生物樣品分析方法要求。

表1 左旋多巴精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Precision and accuracy of the HPLC method for levodopa（n＝5，±s）

表1 左旋多巴精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Precision and accuracy of the HPLC method for levodopa（n＝5，±s）

加入質(zhì)量濃度／μg·mL－1測得日間質(zhì)量濃度RSD／% 測得日內(nèi)質(zhì)量濃度RSD／% RE／%／μg·mL－1 ／μg·mL－1 0.078 0.068±0.004 8.10 0.064±0.09 13.52 12.81 2.5 2.45±0.143 5.81 2.45±0.18 7.20 2.04 20 19.16±0.781 4.07 19.20±0.81 4.24 4.21

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取空白血漿500μL，按2.5項(xiàng)下方法操作配制左旋多巴低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg·mL－1）的 QC樣本，對每一質(zhì)量濃度進(jìn)行5樣本分析；分別考察處理后的血漿樣品于室溫放置24h、血漿樣品在－80℃冰箱中長期冷凍貯藏（28d）及反復(fù)凍融的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。處理后的樣品溶液于室溫放置24h、血漿樣品在－80℃冰箱中長期冷凍貯藏（28d）及反復(fù)凍融3次，左旋多巴含量均穩(wěn)定，符合生物樣品測定的要求。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of sample stability test（n＝5）

2.8 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿500μL，照2.5項(xiàng)下方法，制備左旋多巴低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg·mL－1）的質(zhì)量控制樣品（n＝5）。另取空白血漿500μL，加等量的60 mL·L－1的高氯酸，渦旋2min，以10 000r·min－1離心10min，取上清液，加入相應(yīng)的左旋多巴對照品溶液，制成左旋多巴低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg· mL－1）的未經(jīng)提取的對照樣品（n＝5）。取不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用60 mL·L－1高氯酸稀釋制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg·mL－1）的左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)對照樣品（n＝5），進(jìn)樣20μL檢測。結(jié)果表明，測定血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度分析方法的提取回收率分別為108.62%±12.42%，113.89%±6.51%和105.05%±4.22%，基質(zhì)效應(yīng)分別為 118.8% ±18.3%，92.7%±4.78%和90.60%±2.0%，均符合生物樣品分析方法的要求。

2.9 Beagle犬體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.9.1 血漿采集 6只健康Beagle犬，雄性，禁食12h（自由飲水）后，分別給予左旋多巴胃內(nèi)微囊漂浮片1片（每片含左旋多巴約100mg），并在給藥后多點(diǎn)前肢靜脈采血（給藥2h后給水，4h后進(jìn)食），采血時(shí)間點(diǎn)為0.167，0.333，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，9和12h，所采血樣肝素抗凝，離心提取血漿于－80℃冰箱保存，待測。

2.9.2 數(shù)據(jù)處理 血樣按2.1項(xiàng)下HPLC色譜條件測定血藥質(zhì)量濃度，所得數(shù)據(jù)用中國藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)編制的3P97藥代動(dòng)力學(xué)程序處理。根據(jù)AIC值判定左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，符合單室模型。6只Beagle犬單劑量給予左旋多巴胃內(nèi)微囊漂浮片的平均血藥質(zhì)量濃度－時(shí)間曲線見圖2。對血藥質(zhì)量濃度進(jìn)行處理，計(jì)算比格犬口服左旋多巴微囊漂浮片后的主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分別為：t1／2（1.09±0.46）h，Cl（32.78±10.24）L·h－1，Ka（1.5±0.44）h－1，tmax（1.32±0.54）h，Cmax（1.33±0.31）μg·mL－1，AUC為（3.31±1.26）μg·h·mL－1。

圖2 比格犬口服左旋多巴微囊漂浮片后的平均藥－時(shí)曲線Fig.2 Mean plasma concentration vs time plots of Levodopa Microcapsules Intragastric Floating Tablets in Beagle dogs after a single oral administration

3 討論

3.1 左旋多巴的含量測定方法的選擇 在文獻(xiàn)報(bào)道中，高效液相成本比色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［6－7］低，儀器在國內(nèi)比較普及，其中熒光檢測比紫外［8－9］靈敏度高，同時(shí)比電化學(xué)法［10－11］簡便，而測定結(jié)果比毛細(xì)管電泳法［12］穩(wěn)定、重復(fù)性好，所以采用 HPLC－熒光檢測。

3.2 對照品溶液溶劑的選擇 由于左旋多巴在乙醇、氯仿中不溶，在水中微溶，在稀酸中易溶［13］，曾用純水溶解左旋多巴對照品，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對照品的保留時(shí)間與經(jīng)過處理的樣品的RT值偏移比較明顯，因此，選用體外實(shí)驗(yàn)時(shí)表現(xiàn)穩(wěn)定的稀鹽酸作溶劑配制左旋多巴對照品溶液。

3.3 樣品處理方法的選擇 沉淀法處理樣品易操作、效率高、成本低，故直接選擇考察蛋白沉淀劑，分別考察了等量和1／2量的200mL·L－1高氯酸、乙腈、氯仿與60mL·L－1高氯酸作為蛋白沉淀劑的分離效果，其中以60mL·L－1高氯酸處理后左旋多巴與相鄰峰分離效果最優(yōu)。同時(shí)，據(jù)報(bào)道，以高氯酸沉淀蛋白，當(dāng)血樣與高氯酸體積比為1∶1時(shí)蛋白沉淀率可達(dá)99%。因此，選擇加入等量的60mL·L－1高氯酸進(jìn)行樣品前處理。

3.4 液相條件的選擇 分別考察了下列條件對樣品測定結(jié)果的影響：柱溫（30，35和40 ℃）；流速（0.5，0.8和1.0mL·min－1）；流動(dòng)相比例（水－甲醇為90∶10，92∶8和95∶5）；流動(dòng)相pH 值（3.2，3.7和4.2）。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相（pH 約為3.7）為水－甲醇（為95∶5）、流速為0.5mL·min－1、柱溫為35℃時(shí)，能夠獲得更為理想的色譜峰。

3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的預(yù)考察 在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，直接給予Beagle犬左旋多巴片劑后1h左右，犬會(huì)出現(xiàn)不同程度的惡心，嘔吐出黃色的胃容物。為避免胃腸道不良反應(yīng)影響藥物吸收，在實(shí)驗(yàn)前30min先給予1片多潘立酮片以防止嘔吐。文獻(xiàn)報(bào)道［14］，左旋多巴與多潘立酮沒有藥物動(dòng)力學(xué)相互作用。預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)左旋多巴在犬體內(nèi)達(dá)峰時(shí)間約為90～120min左右，而所采的24h的血樣中幾乎檢測不出左旋多巴，因此，調(diào)整采血時(shí)間點(diǎn)為0.167，0.333，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，9和12h。結(jié)果表明，該采血點(diǎn)設(shè)計(jì)能夠滿足藥動(dòng)學(xué)研究的要求。

3.6 初步的藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果 該微囊漂浮片中左旋多巴在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為符合單室模型。與文獻(xiàn)報(bào)道的美多芭藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)相比，左旋多巴的的達(dá)峰時(shí)間延長，半衰期延長，具有比較明顯的緩釋制劑特征，提示漂浮片中左旋多巴的體內(nèi)滯留時(shí)間有所延長，這可能是因?yàn)槠∑凶笮喟偷谋碛^分布容積發(fā)生改變的緣故。以上結(jié)果尚需通過生物利用度比較和多劑量給藥等予以確證。

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測定比格犬體內(nèi)左旋多巴質(zhì)量濃度的方法。該法符合方法學(xué)的要求，具有準(zhǔn)確、靈敏、可重復(fù)的特點(diǎn)，可用于開展左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片比格犬體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究。

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