鄭仁朝王天真黎小軍鄭裕國

1 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310032

2 浙江工業(yè)大學(xué) 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310032

普瑞巴林 (Pregabalin)，化學(xué)名 (S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸 (GABA)的3位異丁基取代物，屬鈣離子通道調(diào)節(jié)劑[1]。普瑞巴林于2005年9月以商品名“Lyrica”首次在美國上市，目前已成為全球增長最快的藥物之一[2]，被國際疼痛學(xué)會 (IASP)、歐洲神經(jīng)病理學(xué)會聯(lián)盟 (EFNS)和英國國立衛(wèi)生與臨床研究所 (NICE)等多個國際權(quán)威指南推薦為治療神經(jīng)病理性疼痛的一線藥物[3-5]。美國輝瑞公司最新年報顯示，Lyrica?2012年全球銷售額高達(dá)41.6億美元[6]。

由于普瑞巴林廣闊的市場前景，其規(guī)?；粚ΨQ合成技術(shù)成為制藥工程研究的熱點，合成新方法不斷涌現(xiàn)[7]。其中，輝瑞公司引入脂肪酶手性生物催化開發(fā)成功的化學(xué)-酶法工藝是目前最高效的普瑞巴林生產(chǎn)方法[8]。與第一代全化學(xué)合成工藝相比，新一代化學(xué)-酶法通過拆分步驟前移、無效單體回用和原位脫羧等技術(shù)使環(huán)境因子 (E factor)由86降至8[9]，大幅減少了原料消耗和“三廢”排放。該新工藝的核心是獲得能夠立體選擇性水解rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯 (CNDE)生成 (3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的水解酶。輝瑞公司規(guī)?；a(chǎn)所用水解酶為諾維信商品化脂肪酶Lipolase?，生產(chǎn)成本高，且已申請專利保護(hù)[10]。因此，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)、能夠高效拆分CNDE的新酶源成為普瑞巴林酶法合成的關(guān)鍵。

本實驗室經(jīng)前期大量篩選，首次報道了能夠高效對映選擇性拆分CNDE的摩氏摩根菌Morgarella morganii ZJB-09203[11]。文中主要對M. morganii ZJB-09203產(chǎn)生的酯水解酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，為今后酶分子改造提高催化效率和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

標(biāo)準(zhǔn)牛血清清蛋白 (Sigma公司)；rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯、(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸 (浙江某醫(yī)藥公司饋贈)；不同碳鏈長度對硝基苯酯 C2 (p-NP acetate)、C4(p-NP butyrate)、C6 (p-NP hexanoate)、C10 (p-NP decanoate)、 C12 (p-NP laurate)、 C16 (p-NP palmitate)(J&K Chemical)；Phenyl Sepharose 6 FF 和DEAE Sephadex A-50 (GE公司)；其他常用試劑均為市售分析純。Agilent 7890氣相色譜儀 (美國安捷倫公司)；GC-14C氣相色譜儀 (日本島津)；超濾濃縮管 (MWCO 10 kDa，Millipore公司)；Microfuge 22R高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司)；5 mL Bio-Scale CHT預(yù)裝柱、Mini-Protein Ⅱ電泳儀型、BioLogic LP低壓層析系統(tǒng)和凝膠成相儀 (Bio-Rad公司)。

1.1.2 菌種

摩氏摩根菌M. morganii ZJB-09203由本實驗室分離并鑒定[11]，并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC No. M 2011175。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1) 斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h；2) 種子培養(yǎng)基(W/V)：1.0%葡萄糖，0.3%牛肉膏，0.01% Fe2(SO4)3，0.1%Na2HPO4，30 ℃、180 r/min培養(yǎng) 24 h；3)發(fā)酵培養(yǎng)基(W/V)：1.5%葡萄糖，0.7%牛肉膏，0.01%Fe2(SO4)3，1.0%吐溫-80，0.1% Na2HPO4，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h。

1.3 酶活測定和蛋白質(zhì)濃度測定

在體系中加入1 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 9.0)和970 μL酶液，置于40 ℃保溫10 min，加入30 μL CNDE (終濃度 50 mmol/L)，40 ℃下150 r/min振蕩反應(yīng)60 min，用50 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。氣相色譜法檢測2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸生成量。酶活力的定義為：在上述條件下，每分鐘生成 1 μmol (3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需酶量定義為一個酶活力單位(U)。蛋白質(zhì)濃度定量分析采用Bradford法。

1.4 底物、產(chǎn)物含量與光學(xué)純度的檢測方法

底物、產(chǎn)物含量用氣相色譜Agilent 7890測定，色譜柱類型：HP-5弱極性色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，初始柱溫 130 ℃，以 5 ℃/min程序升溫至 165 ℃，載氣為氮?dú)?，載氣流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1，檢測器及進(jìn)樣口溫度均為250 ℃。

底物、產(chǎn)物光學(xué)純度 (eeS、eeP)用氣相色譜GC-14C測定，色譜柱類型：Chiraldex G-TA(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫 135 ℃，載氣為氦氣，流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比40∶1，檢測器及進(jìn)樣口溫度均為220 ℃。產(chǎn)物和底物各異構(gòu)體的保留時間分別為：(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸 10.8 min，(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸 11.7 min；(R)-CNDE 38.2 min，(S)-CNDE 39.2 min。

1.5 摩氏摩根菌酯水解酶的分離純化

1.5.1 粗酶液的制備

發(fā)酵液于4 ℃離心 (12 000 r/min，10 min)收集菌體，重懸于一定量的Tris-HCl 緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)中，在冰浴條件下超聲破碎菌體 (破碎功率300 W，工作1 s，停1 s)，破碎液冰浴中靜置0.5 h，以利于酶的進(jìn)一步釋放。12 000 r/min離心15 min，收集上清液得粗酶液，記為酶液Ⅰ。

1.5.2 硫酸銨分級沉淀

將研細(xì)的固體硫酸銨加入到粗酶液中，調(diào)至不同的飽和度 (20%?80%)，0 ℃冰浴下靜置4 h，4 ℃、15 000 r/min 離心 10 min，分離上清與沉淀，沉淀用Tris-HCl緩沖液 (50 mmol/L，pH 8.0)復(fù)溶，并進(jìn)行蛋白濃度和活性測定，確定最優(yōu)鹽析條件。

1.5.3 Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析

硫酸銨鹽析得到的沉淀用 Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)溶解后記為酶液Ⅱ。上樣于Phenyl Sepharose 6 FF 疏水層析柱，然后用緩沖液buffer A：pH 8.0 PBS (含有1.8 mol/L硫酸銨)平衡，再用低鹽緩沖液洗脫。所用的低鹽緩沖依次有緩沖液 B：PBS (50 mmol/L，pH 8.0)以及緩沖液 C: Tris-HCl (50 mmol/L，pH 8.0)，緩沖液 D為純水。采用梯度洗脫，收集的酶活集中部分，記為酶液Ⅲ。

1.5.4 DEAE Sephadex A-50 陰離子交換

將收集的酶液Ⅲ進(jìn)行 DEAE陰離子交換層析分離，首先用低鹽的緩沖液 A (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)平衡，上樣后再用高鹽的緩沖液B (緩沖液 A + 1 mol/L NaCl)洗脫。洗脫時采用分步洗脫，洗脫緩沖液分別是含0、0.05、0.1、0.2和1.0 mol/L NaCl。每部分洗脫液體積為 3?5個柱體積。檢測各洗脫液的蛋白濃度及酶活，并將有活性的洗脫液混合，記為酶液Ⅳ。

1.5.5 羥基磷灰石Bio-Scale CHT層析

酶液Ⅳ透析脫鹽后進(jìn)行羥基磷灰石層析，首先采用磷酸鉀緩沖液(20 mmol/L，pH 8.0)平衡，再用濃度為0.5 mol/L的緩沖液 (pH 8.0)梯度洗脫，收集檢測有活力的部分，記為酶液Ⅴ。

1.6 分離純化效果和蛋白分子量檢測

采用 12% SDS-PAGE，蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán) R-250染色，用于檢測目的蛋白的純化效果及測定蛋白表觀分子量。

蛋白分子量的測定采用高效液相色譜凝膠過濾層析法測定。Shimadzu LC-10Avp HPLC液相系統(tǒng)，色譜柱為UtrahydrogelTM250水相凝膠柱 (7.8 cm×30 cm, 6 μm)。流動相為純凈水，流速0.5 mL/min，檢測波長280 nm。根據(jù)酶蛋白與其他標(biāo)準(zhǔn)蛋白保留時間關(guān)系計算分子量。所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白及其分子量為：磷酸化酶B (97.2 kDa)，牛血清蛋白 (66.4 kDa)，卵清蛋白 (43.0 kDa)，碳酸酐酶 (30.0 kDa)，胰蛋白酶抑制劑 (20.1 kDa)和 α-乳清蛋白 (14.4 kDa)。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 底物特異性

以不同碳鏈長度的p-硝基苯酚酯為底物，對純化的酯水解酶進(jìn)行底物譜研究。反應(yīng)體系為：對硝基苯酚酯與乙醇的混合溶液80 μL，Tris-HCl 緩沖液 (pH 8.0，50 mmol/L)1 720 μL，純化后的酶液200 μL。對照組用200 μL Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0，50 mmol/L)代替酶液。室溫下反應(yīng)5 min，測定405 nm吸光值變化，每組實驗重復(fù)3次，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.7.2 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

1) 最適反應(yīng) pH：分別在pH 5.0–7.0 的 50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.5–9.0的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液和pH 9.0–10.0 的50 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液中， 40 ℃下測定酶活力和 eeP，考察純酶的最適pH。 2) pH 穩(wěn)定性：將酶液置于不同pH (5.0–10.0)的緩沖液中于4 ℃放置24 h，然后于最適pH條件下測定其對應(yīng)殘留酶活力。以活力最高值為100%，計算相對活力。

1.7.3 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

1) 最適反應(yīng)溫度：在酶的最適反應(yīng) pH 條件下，分別測定純酶在30 ℃–60 ℃的酶活力，通過酶活力和eeP考察酶的最適反應(yīng)溫度。2)熱穩(wěn)定性：在50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 (pH 8.5)中，將酶液分別置于40 ℃、45 ℃、50 ℃保溫，在不同時間分別取樣并在最適溫度下測定其相應(yīng)的殘留酶活力，以活力最高值為100%，考察酶的熱穩(wěn)定性。

1.7.4 金屬離子對酶活力的影響

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為5 mmol/L的Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Ba2+、Mg2+、Li+、Al3+和EDTA，在40 ℃下反應(yīng)60 min測定酶活和eeP，考察金屬離子對酶活的影響。

1.7.5 摩氏摩根菌酯酶的動力學(xué)參數(shù)測定

在40 ℃下，測定酯酶的反應(yīng)初速度，利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法求出該酶的Km值及Vmax。將不同濃度的p-硝基苯酚酯乙醇溶液加入Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0, 50 mmol/L)中，其中乙醇最終體積分?jǐn)?shù)4%，對硝基苯酚酯終濃度范圍為0.01?0.25 mmol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 摩氏摩根菌酯水解酶的分離純化

酯酶經(jīng)35%和65%的飽和硫酸銨分級沉淀、Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析、DEAE Sephadex A-50 陰離子交換和Bio-Scale CHT層析后，分離得到能夠?qū)τ尺x擇性水解CNDE的水解酶。純化后，該酶比活力由0.18 U/mg提高到15.61 U/mg，純化倍數(shù)為86.7倍，回收率為6.5%(表1)。SDS-PAGE結(jié)果 (圖1)表明，純化后的酶蛋白為單一條帶，說明得到了電泳純目標(biāo)蛋白，其表觀分子量約為 72 kDa。進(jìn)一步利用凝膠過濾HPLC測定了該酶的分子量。該酶蛋白的保留時間為14.4 min (圖2)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，算得其分子量為68.0 kDa。同時結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果，表明該酶為單亞基酶，亞基分子量為68.0 kDa。

表1 M. morganii ZJB-09203酯水解酶的純化Table 1 Purification of carboxyl esterase from M. morganii ZJB-09203

圖1 M. morganii ZJB-09203酯水解酶的SDS-PAGEFig. 1 SDS-PAGE analysis of purified carboxyl estersase from Morgarella morganii ZJB-09203. 1:protein marker; 2: concentrated purified enzyme.

圖2 純化后M. mo rganii ZJB-09203酯水解酶的液相譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of the purified enzyme.

2.2 摩氏摩根菌酯水解酶的底物特異性

由于脂肪酶和酯酶均可能水解 CNDE酯鍵。脂肪酶和酯酶的顯著區(qū)別在于偏好底物的鏈長不一致：脂肪酶偏向于水解碳鏈較長的酯類 (>10個碳原子)，而酯酶偏好水解碳鏈較短的酯類(<10個碳原子)[12]。為了確定M. morganii ZJB-09203酯水解酶類型，考察了該酶對不同碳鏈長度p-硝基苯酚酯的活性，如圖 3所示。該酶與枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis RRL1789酯酶[13]表現(xiàn)出類似的底物偏好性，對碳鏈較短底物 (C4，C6)的酶活較高，而對碳鏈較長酯類(C10，C12，C16)的活力明顯下降，對 p-硝基苯酚棕櫚酸酯 (C16)的活力僅為對p-硝基苯酚己酸酯的1%。據(jù)此可推斷該酯水解酶為酯酶。

2.3 酯酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酯酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

圖3 M. morganii ZJB-09203酯水解酶的底物特異性Fig. 3 Substrate specificity of the carboxyl esterase from M. morganii ZJB-09203. The activity towards p-nitrophenyl hexanoate was taken as 100%.

圖4 pH對酯酶活力 (A)及穩(wěn)定性 (B)的影響Fig. 4 Effect of pH on the activity (A)and stability (B)of esterase from M. morganii ZJB-09203.

1)最適反應(yīng) pH：pH 對酯酶活力影響結(jié)果見圖 4A。該酶在 pH 8.5–9.5酶活力較好，當(dāng)pH＜8.0 或 pH＞9.5 時酶活力下降。以磷酸鹽和 Tris-HCl緩沖液為反應(yīng)體系時，產(chǎn)物光學(xué)純度較高，而改用Gly-NaOH緩沖液時，eeP下降至 90%以下。pH穩(wěn)定性實驗結(jié)果見圖 4B，該酯酶在pH 8.0–9.0、4 ℃下放置24 h保持原活力的94%左右。而當(dāng)pH＜8.0 或 pH＞9.0時酶活力損失較大。

2.3.2 酯酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

1) 最適反應(yīng)溫度：酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果表明，該酯酶在40 ℃–45 ℃間具有較高活力，最適溫度為45 (℃圖5A)。2)熱穩(wěn)定性：酶的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，當(dāng)溫度低于 40 ℃時，酯酶穩(wěn)定性良好。在40 ℃保溫30 min，仍保存91.8%活力。但在45 ℃、50 ℃保溫30 min后，其酶活損失分別達(dá)到34.6%和69.5% (圖5B)。

2.3.3 金屬離子及EDTA對酶活力的影響

金屬離子及EDTA 對酶活力影響的實驗結(jié)果見表2。Ca2+、Mn2+和Cu2+對酶活力有一定的激活作用，酶活力分別提高到 112.1%、117.9%和111.7%。Co2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和Ba2+對酶活力均有一定的抑制作用，其中Co2+、Fe3+、Ni2+有強(qiáng)烈的抑制作用，分別抑制了約 33.3%、29.6%和30.5%的酶活力。添加EDTA后，酶活降為原來的69.1%。

2.3.4 M. morganii ZJB-09203酯酶水解動力學(xué)參數(shù)

根據(jù)米氏方程，采用雙倒數(shù)作圖法，繪制該酯酶對 p-硝基苯酚丁酸酯、己酸酯、癸酸酯和月桂酸酯的動力學(xué)曲線，并分別計算其動力學(xué)參數(shù) (表 3)。實驗結(jié)果表明，該酯酶對 4種底物的親和力大小是：C6 > C10 > C4 > C12。

表2 金屬離子和EDTA對酯酶活力的影響Table 2 Effect of mental ions and EDTA on esterase activity

圖5 溫度對酯酶酶活和穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of temperature on the activity (A)and stability (B)of esterase.

2.3.5 M. morganii ZJB-09203酯酶催化CNDE立體選擇性水解

M. morganii ZJB-09203酯酶催化不同濃度CNDE水解進(jìn)程見圖 6。當(dāng)?shù)孜餄舛确謩e為30 mmol/L和60 mmol/L時，轉(zhuǎn)化率在3 h和6 h即達(dá)到45%以上。但隨著CNDE濃度的繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢。200 mmol/L底物濃度下，反應(yīng)時間延長至24 h，轉(zhuǎn)化率僅為31%。在前期 M. morganii ZJB-09203全細(xì)胞催化CNDE水解中，也觀察到高底物濃度下由產(chǎn)物引起的抑制現(xiàn)象[11]。向反應(yīng)體系中添加 Ca2+、Zn2+等二價金屬離子與產(chǎn)物形成絡(luò)合物[8]或加入大孔吸附樹脂進(jìn)行原位分離[11]可顯著解除底物抑制現(xiàn)象。

表3 M. morganii ZJB-09203 酯酶的動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic constants of M. morganii ZJB-09203 esterase

圖6 M. m organii ZJB-09203酯酶催化不同濃度CNDE水解Fig. 6 Time courses of CNDE hydrolysis at different concentrations catalyzed by M. morganii ZJB-09203 esterase.

3 結(jié)論

新酶源的發(fā)現(xiàn)是生物催化工藝開發(fā)至為關(guān)鍵的第一步。在普瑞巴林化學(xué)-酶法工藝開發(fā)過程中，輝瑞公司篩選了大量商品化水解酶[10]，發(fā)現(xiàn)疏綿狀嗜熱絲孢菌 Thermonyces lanuginosus脂肪酶 (商品名 Lipolase?)和德式根霉Rhizopus delemar脂肪酶對CNDE具有優(yōu)良的S-立體選擇性 (E>200)，而商品化酯酶(如pig liver esterase和cholesterol esterase)基本無選擇性 (E=2)[8]。除筆者課題組發(fā)現(xiàn)的 M.morganii ZJB-09203酯水解酶外，能夠?qū)τ尺x擇性水解S -型CNDE的非商品化生物催化劑迄今未見報道。因此，對M. morganii ZJB-09203產(chǎn)生的酯水解酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，對于建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的普瑞巴林化學(xué)-酶法工藝和實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用具有一定的意義。

本文首先通過硫酸銨沉淀和3步柱層析，首次分離純化了摩氏摩根菌酯水解酶，獲得了電泳純酶，并利用凝膠過濾HPLC測定其分子量為68 kDa。該酶水解CNDE的比活力達(dá)到15.6 U/mg。酯水解酶對不同碳鏈長度對硝基苯酚酯底物的偏好性是區(qū)分脂肪酶和酯酶的重要依據(jù)[14-15]，通過純酶底物特異性分析，確定M. morganii ZJB-09203選擇性水解CNDE的酶為酯酶。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酯酶最適pH范圍為8.5?9.5，最適溫度范圍為40 ℃?45 ℃。與沃氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii 16C-1酯酶類似[16]，該酶在 pH 7.0?9.0和低于40 ℃時具有良好的穩(wěn)定性。金屬離子對不同微生物源酯酶的活性影響不一，如擴(kuò)展短桿菌Brevibacterium linens ATCC 9174酯酶受多種二價金屬離子的抑制[17]；Micrococcus sp. YGJ1酯酶受Hg2+、Cu2+強(qiáng)烈抑制，而Fe3+、Ni2+、Co2+等對其無顯著影響[18]；Mn2+對活性污泥宏基因組來源酯酶EstAS具有較強(qiáng)激活作用，但受Cu2+的抑制[19]。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Cu2+、Mn2+對該酯酶活性有一定的促進(jìn)作用，而Co2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和Ba2+對酶活有不同程度的抑制作用。與地芽胞桿菌Geobacillus sp. HBB-4[20]和A. lwoffii 16C-1[16]酯酶類似，該酶受EDTA抑制，說明金屬離子對酶活具有一定的激活作用，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

酯酶由于不需輔酶、耐受有機(jī)溶劑和高立體選擇性等優(yōu)勢，成為制藥和精細(xì)化工工業(yè)中常用的重要生物催化劑[21-22]，廣泛用于手性醇和手性羧酸的合成。本研究首次從摩氏摩根菌中分離純化獲得酯酶，后續(xù)研究經(jīng)胰蛋白酶酶切并利用 LC/MS/MS測定了其多肽氨基酸序列。通過NCBI序列比對和引物設(shè)計，該酯酶的結(jié)構(gòu)基因正在克隆中。這些工作將為探索酯酶蛋白結(jié)構(gòu)與分子機(jī)理，構(gòu)建更為高效的生物催化劑奠定基礎(chǔ)。

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