甄杰，胡政，李樹芳，徐健勇，宋詼

1 天津科技大學(xué)，天津 300457

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

淀粉 (Starch)是植物中普遍存在的儲藏多糖，是植物體內(nèi)能量的儲備物質(zhì)。淀粉有兩種結(jié)構(gòu)形式，一種是直鏈淀粉 (Amylose)，另一種是支鏈淀粉 (Amylopectin)。直鏈淀粉是由葡萄糖通過α-1,4-糖苷鍵連接組成的，是不分支類型的淀粉；支鏈淀粉中除有α-1,4-糖苷鍵外，還有4%–5%的α-1,6-糖苷鍵。工業(yè)淀粉制糖生產(chǎn)中，淀粉首先經(jīng)過高溫液化步驟，經(jīng)過 α-淀粉酶(α-Amylase)水解，將高聚糖水解為低聚糖，這一過程的反應(yīng)條件為pH 6.0、溫度95 ℃?105 ℃。液化產(chǎn)生的低聚糖隨后在 β-淀粉酶(β-Amylase)、葡萄糖淀粉酶 (Glucoamylase)和普魯蘭酶 (Pullulanase)、以及異淀粉酶(Isoamylase)等作用下，殘留的直鏈α-1,4-糖苷鍵和支鏈α-1,6-糖苷鍵被進(jìn)一步水解，最終形成葡萄糖漿，該過程稱為糖化步驟，其最適酶促條件為 pH 4.5、溫度 60 ℃?62 ℃[1-3]。

普魯蘭酶 (Pullulanase，EC 3.2.1.41)，也稱去分支酶，是一種專一性水解支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1,6-糖苷鍵的葡萄糖苷水解酶，可特異性地將支鏈淀粉水解形成長度不同直鏈淀粉，是糖苷水解酶13家族成員之一[4]。在淀粉加工工業(yè)中，普魯蘭酶與糖化酶等的聯(lián)合應(yīng)用可有效地提高淀粉的水解效率和葡萄糖的產(chǎn)量，廣泛地應(yīng)用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒生產(chǎn)等應(yīng)用中，是一種重要的工業(yè)酶。

本論文從我國云南輪馬熱泉下游淤泥中篩選獲得一株耐熱普魯蘭酶產(chǎn)生菌 Anoxybacillus sp.LM18-11，對其所產(chǎn)的耐熱普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究，并在枯草芽胞桿菌中進(jìn)行了高效異源表達(dá)，為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高效耐高溫的普魯蘭酶制劑奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基

菌株Anoxybacillus sp.LM18-11由本實(shí)驗(yàn)室分離，大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21(DE3)、枯草芽胞桿菌 WB600為本實(shí)驗(yàn)室收藏。質(zhì)粒pET32a用于在大腸桿菌中表達(dá)外源基因，大腸桿菌-芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pBE980B (芽胞桿菌質(zhì)粒pWB980的EcoRⅠ位點(diǎn)處插入來源于pUC18的大腸桿菌復(fù)制子，同時去除了原有的SacB信號肽序列)，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，用于在枯草芽胞桿菌WB600中表達(dá)外源基因。

Thermus培養(yǎng)基 (1 L)：1 g 蛋白胨， 1 g 酵母粉，100 mg 氨三乙酸, 60 mg CaSO4·2H2O,100 mg Mg2SO4·7H2O, 8 mg NaCl, 100 mg KNO3, 700 mg NaNO3, 140 mg Na2HPO4·2H2O,0.47 mg FeCl3·6H2O, 2.2 mg MnSO4·H2O, 0.5 mg ZnSO4·7H2O, 0.5 mg H3BO3,25 μg CuSO4·5H2O,25 μg Na2MoO4·2H2O, 46 μg CoCl2·6H2O, 1.5%瓊脂粉, pH 7.8。普魯蘭酶篩選培養(yǎng)基 (1 L)：5 g 蛋白胨, 1 g 酵母粉, 0.7 g NaNO3, 0.1 g Na2HPO4, 0.2 g MgSO4·7H2O, 0.1S g CaCl2, 5 g普魯蘭糖, 1.5% 瓊脂粉。魯格式碘液(300 mL)：1 g I2，2 g KI。常規(guī)LB培養(yǎng)基配制參見文獻(xiàn)[5]。

1.1.2 酶及相關(guān)試劑

實(shí)驗(yàn)所用到的各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶等購自Thermo Fisher公司。腸激酶購自NEB公司。各種抗生素、普魯蘭糖、IPTG等各種化學(xué)試劑購自Sigma公司。蛋白質(zhì)純化用HisTrap柱購自GE公司。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。基因組DNA提取及基因組步移試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 普魯蘭酶產(chǎn)生菌的分離

稱取1 g土樣加入100 mL無菌水，經(jīng)充分混勻靜置30 min后，取上清液1 mL，做適當(dāng)?shù)奶荻认♂專坎加?Thermus固體平板，置于恒溫培養(yǎng)箱60 ℃培養(yǎng)48?72 h。待長出1 mm左右大小的菌落后，再分別轉(zhuǎn)接至普魯蘭酶篩選培養(yǎng)基，60 ℃培養(yǎng)48 h后，在平板表面滴加魯格式碘液，挑選有水解圈的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

1.2.2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作

常規(guī)大腸桿菌的培養(yǎng)、質(zhì)粒提取、轉(zhuǎn)化和DNA基本操作參見文獻(xiàn)[5]，枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化參見文獻(xiàn)[6]。DNA序列測定由天津華大基因完成。

1.2.3 普魯蘭酶在大腸桿菌中表達(dá)及純化

PCR擴(kuò)增的全長普魯蘭酶基因插入到質(zhì)粒pET32a的EcoRⅤ-XhoⅠ位點(diǎn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化子生長到 OD600達(dá)到0.6–0.8時，加入終濃度0.05 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在16 ℃下培養(yǎng)16 h，離心收集菌體，超聲破碎。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)HisTrap柱純化，SDS-PAGE檢測純度。N1端缺失的普魯蘭酶基因的表達(dá)純化方法同上。

1.2.4 蛋白晶體的制備及X-ray衍射

8 mg/mL的蛋白溶液 (25 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl，pH 7.5)經(jīng)過一系列晶體生長條件優(yōu)化，最終在 7% PEG8000、10% 乙二醇和10% 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 7.5)條件下，室溫靜置48 h獲得普魯蘭酶晶體，并進(jìn)行了X-ray衍射。蛋白-底物 (產(chǎn)物)復(fù)合物的晶體 X-ray衍射實(shí)驗(yàn)采用浸泡法，10 mmol/L麥芽三糖 (麥芽四糖)與蛋白晶體浸泡3 h后收集X-ray衍射數(shù)據(jù)。晶體結(jié)構(gòu)圖像的繪制利用 PyMOL軟件(http://www.pymol.org/)。

1.2.5 普魯蘭酶的活性分析

酶活分析采用二硝基水楊酸 (DNS)法[7]，在相應(yīng)的溫度、pH條件下，以0.5%普魯蘭糖為底物，加入0.1 μg普魯蘭酶反應(yīng)10 min，加入DNS液終止反應(yīng)，100 ℃水浴10 min，測定OD540光吸收值。以葡萄糖的DNS顯色OD540光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行標(biāo)定。酶活力單位定義為：在特定的反應(yīng)條件下，每分鐘水解普魯蘭糖產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖，所需的酶量為1活力單位 (U)。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used for this work

2 結(jié)果及分析

2.1 耐熱普魯蘭酶菌株的分離及鑒定

土壤樣品采自中國云南騰沖地區(qū)輪馬溫泉下游的淤泥，采樣點(diǎn)位于北緯 25°25.357、東經(jīng)98°16.442。經(jīng)60 ℃培養(yǎng)共分離獲得4株可水解普魯蘭糖的菌株，挑選出其中一株有明顯普魯蘭水解圈的菌株LM 18-11進(jìn)行進(jìn)一步的分析、鑒定。提取該菌株的基因組DNA，合成16S rDNA擴(kuò)增引物P1和P2，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到一個約1.4 kb的DNA片段，對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行了序列測定 (GenBank Accession No. JF272543)，經(jīng)序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 (圖1)，確定該菌株為厭氧芽胞桿菌屬菌株，將其命名為Anoxybacillus sp. LM 18-11。同時對該菌株所產(chǎn)普魯蘭酶進(jìn)行了分析，對該酶水解普魯蘭糖的產(chǎn)物的進(jìn)行了HPLC分析，結(jié)果顯示該酶水解普魯蘭糖的主要產(chǎn)物為麥芽三糖 (圖2)，這一結(jié)果證實(shí)該酶為Ⅰ型普魯蘭酶。

2.2 耐熱普魯蘭酶編碼基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

圖1 菌株LM18-11的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA of the LM18-11.

圖2 普魯蘭糖水解產(chǎn)物的HPLC分析Fig. 2 HPLC analysis of catalytic products of PulA. (A)The HPLC spectrum of the standards. The peaks of G1,G2 and G3 represent glucose, maltose, respectively. (B)The HPLC spectrum of the pullulan after hydrolysis.

通過在 GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索，獲知在Anoxybacillus屬中，菌株好熱黃無氧芽胞桿菌Anoxybacillus flavithermus WK1已完成了全基因組的測序 (GenBank Accession No. CP000922)，基因組注釋查詢顯示 Anoxybacillus flavithermus WK1編碼一個Ⅰ型的普魯蘭酶，該基因座位被命名為"Aflv_0438"。根據(jù)Ⅰ型普魯蘭酶保守區(qū)進(jìn)行同源比對分析，同時參照該序列，合成引物P3和P4，以Anoxybacillus sp. LM 18-11基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到一個0.6 kb的DNA片段，并對該片段進(jìn)行了測序分析。以該片段為基礎(chǔ)，采用基因組步移技術(shù)，最終擴(kuò)增得到包含一個完整閱讀框序列的DNA片段 (GenBank Accession No. HQ844266)，分析顯示其中 140–2 263 bp為編碼區(qū)，編碼一個由707個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，與Aflv_0438一致性達(dá)84%，相似性達(dá) 91%，該基因被命名為 pulA。合成引物 P5和P6，PCR擴(kuò)增獲得完整的基因編碼區(qū)，經(jīng)酶切后，插入到誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒 pET32a的EcoRⅤ-XhoⅠ位點(diǎn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選正確的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析 (圖3)，證實(shí)基因pulA獲得了正確的表達(dá)，測定酶活力為23 U/mL。利用引物P6和P7擴(kuò)增獲得的N1端缺失的普魯蘭酶基因也如上述插入到質(zhì)粒pET32a的EcoRⅤ-XhoⅠ位點(diǎn)，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了有效的表達(dá)。

圖3 普魯蘭酶PulA誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of PulA. M: marker; 1:before induction; 2: after induction.

2.3 普魯蘭酶PulA的酶學(xué)性質(zhì)分析

pulA的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物通過HisTrap柱純化、腸激酶消化去除N端融合肽后，經(jīng)SDS-PAGE檢測，獲得純度在95%以上的酶蛋白PulA，被用于進(jìn)行酶活性分析。

2.3.1 普魯蘭酶PulA最適反應(yīng)溫度、最適pH的分析

普魯蘭酶PulA反應(yīng)最適pH的分析是通過測定 PulA 在一系列緩沖液 (乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.0–5.5)；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液 (0.1 mol/L，pH 5.5–7.5)；Tris-鹽酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.5–9.0)中，溫度在55 ℃的條件下的催化活性完成的 (圖 4)，分析結(jié)果顯示，普魯蘭酶PulA的最適pH為6.0，在pH 5.6–6.4的范圍內(nèi)，酶活力在90%以上。最適反應(yīng)溫度的測定是在pH 6.0的條件下，測定一系列溫度范圍下的催化活性，分析表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為55–60 ℃ (圖 5)。

2.3.2 普魯蘭酶PulA的酶動力學(xué)常數(shù)分析

圖4 pH對普魯蘭酶PulA活性的影響Fig. 4 Relative activity of PulA at different pH.

圖5 溫度對普魯蘭酶PulA活性的影響Fig. 5 Relative activity of PulA at different temperature.

圖6 普魯蘭酶PulA的雙倒數(shù)曲線Fig. 6 Lineweaver–Burk plot of PulA.

在60 ℃、pH 6.0的條件下，通過測定0.1 μg普魯蘭酶PulA在一系列普魯蘭糖濃度(1.0、1.25、1.33、2.0、2.5、3.33和5.0 mg/mL)的條件下的表觀催化速度，繪制 1/V-1/[S]雙倒數(shù)曲線 (圖 6)，通過米氏方程計算出普魯蘭酶PulA的Vmax和Km分別為750 U/mg和1.47 mg/mL。

2.3.3 普魯蘭酶PulA的熱穩(wěn)定性分析

將普魯蘭酶PulA分別置于55 ℃、60 ℃、65 ℃條件下溫育不同的時間后，取出0.1 μg普魯蘭酶PulA在pH 6.0、60 ℃條件下測定殘余酶活性。結(jié)果顯示PulA具有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過60 ℃下熱處理48 h，仍可保持50%以上的活性 (圖7)。

2.3.4 金屬離子、化學(xué)試劑等對普魯蘭酶PulA的影響

在反應(yīng)液中分別加入不同的離子 (試劑)，測定酶活的改變。結(jié)果顯示Mg2+對普魯蘭酶PulA活性有一定的促進(jìn)作用，Li+、K+、Ca2+、Ba2+、二硫蘇糖醇 (DTT)等對酶活沒有顯著影響；Mn2+、Ni2+和Fe3+抑制普魯蘭酶PulA的活性；1 mmol/L Cu2+可使PulA的活性完全消失；EDTA也在一定程度上抑制PulA的活性，添加50 mmol/L Ca2+或Mg2+可部分恢復(fù)普魯蘭酶的活性 (表2)。

2.4 普魯蘭酶晶體的獲得及X-ray分析

純化后的普魯蘭酶在7% PEG8000, 10% 乙二醇, 10% HEPES (pH 7.5)的條件下獲得了晶體 (圖8A)，并經(jīng)X-ray衍射分析，蛋白-產(chǎn)物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)采用浸泡法收集，分辨率達(dá)到2.2 ? (圖8B)。晶體結(jié)構(gòu)分析顯示該酶具有4個相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，其中催化中心結(jié)構(gòu)域(A domain)具有糖苷水解酶13家族中典型的催化中心活性結(jié)構(gòu)域[4]，位于412位天冬氨酸、422位的谷氨酸和 526位的天冬氨酸是與催化重要相關(guān)的氨基酸；C端具有一個與催化結(jié)構(gòu)域緊密作用的結(jié)構(gòu)域 (C domain)，PCR缺失實(shí)驗(yàn)表明該結(jié)構(gòu)域的缺失將導(dǎo)致酶功能的完全喪失；在N端具有一個獨(dú)立的結(jié)合域 (N1 domain)，與底物的結(jié)合有關(guān)，N1結(jié)構(gòu)域缺失了的普魯蘭酶PulA-N1的酶促反應(yīng)動力學(xué)分析顯示Vmax和Km分別為324 U/mg和1.95 mg/mL (圖略)，這一結(jié)果證實(shí)該結(jié)合域的缺失可導(dǎo)致酶活力和底物結(jié)合力的降低；N2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定具有重要的作用，N2域缺失后表達(dá)的蛋白形成包涵體，上清液SDS-PAGE檢測不到可溶性蛋白，同時也檢測不到酶活性。此外，在該酶的催化活性域中還具有一個 Ca2+結(jié)合區(qū)，與 Ca2+緊密結(jié)合。EDTA螯合實(shí)驗(yàn)表明Ca2+的去除對該酶的催化活力沒有顯著的影響 (表 2)，但額外添加Ca2+可提高酶的熱穩(wěn)定性，在65 ℃下，普魯蘭酶PulA的半衰期由2 h提高到12 h，表明Ca2+可能在酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上發(fā)揮重要作用。

表2 金屬離子、化學(xué)試劑等對普魯蘭酶PulA的影響Table 2 Effect of metal ions and reagents on PulA activity

2.5 普魯蘭酶基因在枯草芽胞桿菌中的異源表達(dá)

圖7 普魯蘭酶PulA的熱穩(wěn)定性Fig. 7 Thermostability of PulA.

圖8 普魯蘭酶PulA的晶體 (A)及酶蛋白-麥芽三糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu) (B)Fig. 8 Crystal of PulA (A)and overall structure of PulA-maltotetraose complex (B). The secondary structural elements of PulA was shown and each domain was indicated: N1 (blue), N2 (green), A (cyan for α-helix, purple for β-strand), and C (yellow), CTT represent maltotriose.

利用引物P8和P9，擴(kuò)增全長的普魯蘭酶基因pulA，經(jīng)XhoⅠ-PstⅠ酶切后，插入到經(jīng)過同樣酶切的質(zhì)粒 pBE980B位點(diǎn)上，重組質(zhì)粒中pulA位于芽胞桿菌組成型強(qiáng)啟動子P43的下游。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子后，提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌WB600，轉(zhuǎn)化子 WB600(pBE980B-pulA)在 LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h，上清液的酶活達(dá)到42 U/mL (pH 6.0、60℃)，相比原始菌株Anoxybacillus sp. LM 18-11 (1.02 U/mL)，表達(dá)量提高了40倍以上。

3 討論

自上世紀(jì)70年代起，酶制劑工業(yè)逐漸成為一個重要的產(chǎn)業(yè)，目前世界酶制劑總產(chǎn)值達(dá)數(shù)百億美元，淀粉水解酶類作為第二大類酶制劑，尤其是近年來隨著生物質(zhì)能源開發(fā)的興起，淀粉已成為生產(chǎn)乙醇的重要原料，淀粉水解相關(guān)的酶類更加顯示出巨大的市場前景。自然界中的淀粉大多為支鏈淀粉，其中含有 4%?5%的α-1,6-糖苷鍵，為提高淀粉的水解作用，提高淀粉利用率，降低生產(chǎn)成本，提高效益，世界各國紛紛研究開發(fā)普魯蘭酶。目前，普魯蘭酶的生產(chǎn)商主要是諾維信和杰能科，我國國內(nèi)的普魯蘭酶還基本依賴進(jìn)口。

近些年，普魯蘭酶的研究還主要集中在耐熱、耐酸 (耐堿)高產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選及基因的克隆與表達(dá)[9-20]。本研究從我國云南輪馬熱泉土壤中篩選獲得一株耐熱普魯蘭酶產(chǎn)生菌Anoxybacillus sp.LM 18-11，并從中克隆表達(dá)了耐熱普魯蘭酶的編碼基因，并對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了細(xì)致的研究，研究表明該普魯蘭酶具有極高的催化效率，比活高達(dá)750 U/mg，是目前已有報道中比活力最高的普魯蘭酶[14-28]。其中諾維信普魯蘭酶 Promozyme 200 L的比活為350 U/mg[8]，廣西大學(xué)李美蓉等從臘樣芽胞桿菌中克隆的普魯蘭酶PulB和PulC的最大比活分別為435 U/mg和400 U/mg[15]。晶體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)在該酶的N端有一個底物結(jié)合域，對酶的催化功能有重要的作用。同時該酶還具有良好的熱穩(wěn)定性，在 60 ℃條件下處理48 h，仍可保持50%以上的活力，能很好的適應(yīng)淀粉加工工藝的需要。此外，為了進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量和活性，降低生產(chǎn)成本，真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，我們利用枯草芽胞桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)，使普魯蘭酶在枯草桿菌組成型啟動子的控制下得到了有效的表達(dá)，胞外分泌表達(dá)量達(dá)到了42 U/mL，比原始菌株的表達(dá)量提高了40倍以上，進(jìn)一步的培養(yǎng)基、發(fā)酵條件優(yōu)化研究正在進(jìn)行中。同時，在細(xì)致的晶體結(jié)構(gòu)、蛋白-底物作用方式了解的基礎(chǔ)上，通過理性設(shè)計、定向進(jìn)化等方式，能夠進(jìn)一步提高該酶的熱穩(wěn)定性、催化活力，耐酸、耐堿等特性，使之能夠更好地滿足淀粉加工、洗滌、紡織等工業(yè)生產(chǎn)多方面的需求。本研究為改變我國普魯蘭酶依賴進(jìn)口的局面，獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型耐熱普魯蘭酶，具有重要的意義，有望創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

致謝 本論文的完成要特別感謝中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所郭瑞庭研究員、黃俊祥副研究員、任飛飛博士在蛋白晶體X-ray數(shù)據(jù)收集、結(jié)構(gòu)分析等給予的幫助。

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