譚之磊，王洪翠，魏彧翹，李艷艷，鐘成，賈士儒

天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實驗室，天津 300457

L(+)-酒石酸是一種天然有機(jī)酸，其他旋光性酒石酸在自然界尚未被發(fā)現(xiàn)[1]，其鹽類較穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛。在食品和飲料中可用作食品添加劑，如酸味劑和膨化劑，酸味值約為檸檬酸的1.3倍，而且是葡萄酒生產(chǎn)過程中唯一一種允許添加的酸味劑[2]，對葡萄酒的味道及口感有很重要的影響[3]；在醫(yī)藥方面，可作外科繃帶硬化劑、藥物拆分劑和酒石酸異丁嗪等藥品的成鹽劑[4]；在紡織工業(yè)上，用作酸性還原劑[5]。此外，還可作印染的防染劑、照相顯影劑[6]以及應(yīng)用于電鍍、制革[7]等行業(yè)。酒石酸的生產(chǎn)方法主要有提取法[8]、半生物合成法[9-10]和酶法[11]，目前國內(nèi)生產(chǎn)L(+)-酒石酸主要是采用酶法，利用微生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸[11]的方法，能產(chǎn)生順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的菌種[12-13]有很多，其常用生產(chǎn)菌種主要是棒狀桿菌[14]和諾卡氏菌[15]，此工藝的底物為順式環(huán)氧琥珀酸，其來源復(fù)雜[16]，安全性低，耗能高。氧化葡萄糖桿菌[17]Gluconobacter oxydans可以將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并進(jìn)一步氧化成 2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和 5-酮基-葡萄糖酸[9](5KGA)，其中5KGA在催化劑[10]的作用下能夠轉(zhuǎn)化為L(+)-酒石酸[18]，此方法改善了以上不足之處。Helmut G?risch 等[19-20]篩選出一株核黃素依賴型GA-2-DH酶活缺失型突變株 Gluconobacter oxydans MF1，此突變株不生成2KGA，使5KGA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到84%。文中以不生成2KGA的氧化葡萄糖桿菌Gluconobacter oxydans HGI-1為生產(chǎn)菌株，研究不同碳源和氮源對5KGA生成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

氧化葡萄糖桿菌 Gluconobacter oxydans HGI-1由日本玉川大學(xué)Tatsuo Hoshino教授贈送。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇 25，酵母浸粉 5，蛋白胨 3。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 100，玉米粉3，酵母浸粉 1.67，NH4Cl 1.50，KH2PO40.10，MgSO4·5H2O 0.25，MnSO4·5H2O 0.03，CaCO330。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 100，玉米粉3，酵母浸粉 1.67，NH4Cl 1.50， KH2PO40.10，MgSO4·5H2O 0.25， MnSO4·5H2O 0.03，CaCO30.34。

1.2 培養(yǎng)和檢測方法

1.2.1 種子液制備

從斜面上挑取兩環(huán)菌種于液體種子培養(yǎng)基中，搖床 (30 ℃，180 r/min)培養(yǎng)20 h。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

500 mL三角瓶裝液量為 50 mL，接種量為10%，搖床 (30 ℃，180 r/min)培養(yǎng)72 h。

1.2.3 5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

采用5 L全自動發(fā)酵罐 (BLBIO-XGJG,上海百侖生物科技有限公司)，培養(yǎng)基裝液量為3 L，接種量為10%(V/V)，在發(fā)酵過程中，控制溫度為30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為750 r/min，通氣速率為1 vvm，自動流加6 mol/L KOH控制發(fā)酵過程中的pH在5.50，葡萄糖濃度降至0 g/L時，不再控制pH。發(fā)酵過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.2.4 5-酮基-D-葡萄糖酸的測定

采用高效液相色譜儀(型號：1100，安捷倫(中國)有限公司)測定5-酮基-D-葡萄糖酸的含量。具體條件：反相色譜柱 Themos BDS C18(4.6 mm ID×250 mm)，流動相為 10 mmol/L HClO4[21]，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對5KGA生產(chǎn)的影響

2.1.1 碳源種類對5KGA產(chǎn)量的影響

分別以初始濃度為100 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉作碳源，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖1可知，當(dāng)碳源分別為乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和葡萄糖時，5KGA的產(chǎn)量分別為16.50、11.90、25.00、45.60和98.20 g/L，其中葡萄糖為碳源時5KGA產(chǎn)量最高，這可能是由于蔗糖、麥芽糖、乳糖為二糖，可溶性淀粉為多糖，不易被菌體利用，菌體利用上述碳源時，需先將其水解為單糖，才能被菌體利用生成5KGA。而葡萄糖能直接被菌體利用，更有利于5KGA的生成，因此選用葡萄糖作碳源。

圖1 不同碳源對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of different carbon sources on the 5-keto-gluconic acid production.

2.1.2 葡萄糖濃度對5KGA產(chǎn)量的影響

選擇葡萄糖初始濃度分別為 60、80、100、120和140 g/L，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖2可知，當(dāng)葡萄糖濃度在60–100 g/L時，5KGA的產(chǎn)量隨葡萄糖濃度的增大而增大，100 g/L時最高為 98.21 g/L，而當(dāng)葡萄糖濃度再增大時 5KGA的產(chǎn)量反而下降，這說明較低或較高的葡萄糖濃度皆不適宜5KGA的生成，這可能是由于高濃度的葡萄糖抑制了菌體的生長[22]，從而影響了5KGA的生成。

圖2 不同葡萄糖濃度對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of different glucose concentrations on the 5-keto-gluconic acid production.

2.2 有機(jī)氮源對5KGA生產(chǎn)的影響

2.2.1 有機(jī)氮源種類對5KGA產(chǎn)量的影響

以魚粉、玉米漿、黃豆餅粉和棉籽餅粉為氮源，其蛋白含量分別為55%、40%、38%和40%，按蛋白終含量為1.20%分別添加2.20、3.00、3.15和3.00 g，以酵母粉為(蛋白含量為 68%)對照，其添加量為1.67 g/L，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖3可知，當(dāng)使用酵母粉作氮源時，5KGA產(chǎn)量為98.21 g/L。當(dāng)使用魚粉、玉米漿、黃豆餅粉、棉籽餅作有機(jī)氮源時，5KGA產(chǎn)量分別為101.40、79.20、70.10和62.10 g/L。魚粉和玉米漿作氮源產(chǎn)量較黃豆餅粉、棉籽餅高。魚粉作氮源時產(chǎn)量超過酵母粉作氮源時的產(chǎn)量，雖然差異未達(dá)到顯著性水平(數(shù)據(jù)未列出)，但考慮到魚粉和玉米漿的價格優(yōu)勢，有望作為工業(yè)化生產(chǎn)氮源。

2.2.2 魚粉、玉米漿起始濃度對5KGA產(chǎn)量的影響

圖3 不同氮源對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on the 5-keto-gluconic acid production.

分別添加魚粉(1.50/2.20/3 g)、玉米漿(2/3/4 g)作為氮源，其最終蛋白含量分別為0.80%、1.20%和1.60%，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白含量為1.60%時，魚粉作有機(jī)氮源，5KGA產(chǎn)量最高為109.10 g/L，其次是使用玉米漿時，5KGA產(chǎn)量最高為93.80 g/L。考慮到玉米漿作氮源與魚粉作氮源5KGA產(chǎn)量接近，但價格僅為魚粉的40%左右，文中選擇了玉米漿為氮源，進(jìn)一步做了5 L發(fā)酵罐放大研究。

2.3 5 L自動發(fā)酵罐分批發(fā)酵

5 L自動發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程中，葡萄糖濃度降至0 g/L之前，自動流加6 mol/L KOH控制發(fā)酵過程中的pH在5.50，葡萄糖濃度降至0 g/L后，不再控制 pH。這是由于 1991年 Qazi等[23]發(fā)現(xiàn)pH為5.50 最利于G. oxydans的細(xì)胞生長，且是葡萄糖脫氫酶的最適 pH。5KGA生成過程可分為兩個階段，即先將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，葡糖酸再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成 5KGA[20]，葡萄糖氧化生成葡萄糖酸后，pH下降，葡萄糖濃度降為0 g/L，pH不再降低。在第一階段中，為了保證菌體最大限度地利用葡萄糖并將其氧化成葡萄糖酸，控制 pH為5.50，這有利于細(xì)胞生長和葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸[24]。

圖4 不同蛋白濃度魚粉、玉米漿對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of different protein concentrations of fish meal and corn steep liquor on the 5-keto-gluconic acid production.

由圖5(A)和圖6(A)可知，以酵母粉作有機(jī)氮源時，發(fā)酵9 h葡萄糖的濃度降至0 g/L、5KGA開始生成，10.5 h時生成速率最大、達(dá)到8.60 g/(L·h)，72 h時5KGA產(chǎn)量達(dá)到最大、為105.41 g/L，轉(zhuǎn)化率為90.60%，平均生成速率為 1.44 g/(L·h)。由圖 5B 和 6B 可知，以玉米漿作有機(jī)氮源，18 h時5KGA開始生成，5KGA 生成速率在 26 h時達(dá)最大，為3.48 g/(L·h)，60 h時5KGA產(chǎn)量達(dá)到最大，為93.80 g/L。平均生成速率為1.56 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為85.93%。

圖5 以酵母粉(A)和玉米漿(B)作氮源分批發(fā)酵生產(chǎn)5KGAFig. 5 Time course of batch 5KGA production with yeast extract (A)and corn steep (B)liquor as nitrogen source.

圖6 以酵母粉(A)和玉米漿(B)作氮源5KGA生成速率曲線Fig. 6 Time course of 5KGA specific production rate with yeast extract (A)and corn steep (B)liquor as nitrogen source.

以玉米漿作有機(jī)氮源 5KGA的產(chǎn)量與酵母粉作有機(jī)氮源接近，玉米漿成本遠(yuǎn)低于酵母粉，同時發(fā)酵周期縮短，平均生成速率為1.56 g/(L·h)高于以酵母粉作有機(jī)氮源的平均生成速率1.44 g/(L·h)。

3 討論

三角瓶和5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵放大試驗結(jié)果表明：采用菌株Gluconobacter oxydans HGI-1生產(chǎn) 5KGA，最佳碳源為葡萄糖，最佳濃度為100 g/L。最佳氮源為酵母粉，其次為魚粉、玉米漿?？紤]工業(yè)生產(chǎn)成本問題，選擇玉米漿作為有機(jī)氮源，其最佳添加量為 4 g/L。以葡萄糖為碳源、玉米漿為有機(jī)氮源 5KGA 的發(fā)酵水平達(dá)到了93.80 g/L，平均生成速率為1.56 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為85.93%，發(fā)酵周期較酵母粉縮短15 h，5KGA平均生成速率提高 8.26%，取得了較好的實驗效果。

Hirohide TOYAMA等[25]研究了以葡萄糖為唯一碳源，在葡萄糖濃度為20 g/L (111 mmol/L)、不控制pH條件下，G. suboxydans IFO 12528生成5KGA的產(chǎn)量為12.61 g/L，轉(zhuǎn)化率僅為59%。Helmut G?risch等[19]篩選出一株核黃素依賴型GA-2-DH酶活缺失型突變株 Gluconobacter oxydans MF1，使用酵母粉作有機(jī)氮源，葡萄糖濃度為25 g/L時，5KGA的產(chǎn)量為22.70 g/L，其葡萄糖轉(zhuǎn)化率為84%。與其相比，Gluconobacter oxydans HGI-1以葡萄糖為碳源、玉米漿為有機(jī)氮源生產(chǎn)5KGA轉(zhuǎn)化率與文獻(xiàn)水平相當(dāng)，但以玉米漿作氮源降低了生產(chǎn)成本，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]Kodama S, Yamamoto A, Matsunaga A, et al.Direct chiral resolution of tartaric acid in food products by ligand exchange capillary electrophoresis using copper(II)-D-quinic acid as a chiral selector. J Chromatogr A, 2001, 932(1):139–143.

[2]Palma M, Barroso CG. Ultrasound-assisted extraction and determination of tartaric and malic acids from grapes and winemaking by-products.Anal Chim Acta, 2002, 458(1): 119–130.

[3]Bastos SST, Tafulo PAR, Queiros RB, et al. Rapid determination of tartaric acid in wines. Comb Chem High Throughput Screening, 2009, 12(7): 12–722.

[4]Lou JF. Study on cis-epoxysuccinate hydrolase [D].Zhengjiang: Zhejiang University, 2006 (in Chinese).樓錦芳. 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的研究[D]. 浙江: 浙江大學(xué), 2006.

[5]Willaert R, Vuyst LD. Continuous production of L-(+)-tartaric acid from cis-epoxysuccinate using a membrane recycle reactor. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 71(2): 155–163.

[6]Cao XM, Lü AZ. Optimization of extraction Conditions of tartaric acid from grapes pomace.Hubei Agric Sci, 2011, 50(14): 2930–2933 (in Chinese).曹熙敏, 呂愛枝. 葡萄渣中酒石酸的提取條件優(yōu)化. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 50(14): 2930–2933.

[7]Olivato JB, Nobrega MM, Müller CM, et al.Mixture design applied for the study of the tartaric acid effect on starch/polyester films. Carbohydr Polym, 2013, 92(2): 1705–1710.

[8]Mi S, Li H, Liu J. Optimization of extraction process for L(+)-tartaric acid from vitis quinquangularis lees via response surface methodology. Food Sci Technol, 2012, 33(8):49–53 (in Chinese).米思, 李華, 劉晶. 響應(yīng)面法優(yōu)化毛葡萄酒泥中L(+)-酒石酸. 食品科學(xué), 2012, 33(8): 49–53.

[9]Merfort M, Herrmann U, Ha SW, et al.Modification of the membrane-bound glucose oxidation system in Gluconobacter oxydans significantly increases gluconate and 5-keto-D-gluconic acid accumulation. Biotechnol J,2006, 1(5): 556–563.

[10]Matzerath I, Kl?ui W, Klasen R, et al. Vanadate catalysed oxidation of 5-keto-D-gluconic acid to tartaric acid: the unexpected effect of phosphate and carbonate on rate and selectivity. Inorg Chim Acta, 1995, 237(1): 203–205.

[11]Lou JF, Zhang JG. Research on microbial productions of L(+)-Tartaric acid. Food Sci Technol, 2006, (11): 162–164 (in Chinese).樓錦芳, 張建國. 酶法合成L(+)-酒石酸的研究進(jìn)展. 食品科技, 2006, (11): 162–164.

[12]Pan KX, Min H, Xia Y, et al. Isolation,identification and phylogenetic analysis of Rhodococcus sp. strain M1 producingcis-epoxysuccinate hydrolase and optimization of production conditions. Acta Microbiol Sin, 2004, 44(3): 276–280 (in Chinese).潘克俠, 閔航, 夏穎, 等. 產(chǎn)順式環(huán)氧玻拍酸水解酶的紅球菌 Ml菌株的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化. 微生物學(xué)報, 2004, 44(3): 276–280.

[13]Pan HF, Xie ZP, Bao WN, et al. Isolation and identification of a novel cis-epoxysuccinate hydrolaseproducing Bordetella sp. BK-52 and optimization of enzyme production. Acta Microbiol Sin, 2008, 48(8): 1075–1081 (in Chinese).潘海峰, 謝志鵬, 鮑文娜, 等. 產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的博德特氏菌BK-52的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化. 微生物學(xué)報, 2008, 48(8):1075–1081.

[14]Zhang JG, Qian YJ. Production of L(+)-tartaric acid by immobilized Corynebacterium sp. JZ21.Chin J Biotech, 2000, 16(2): 188–192 (in Chinese).張建國, 錢亞娟. 棒狀桿菌固定化細(xì)胞生產(chǎn)L(+)-酒石酸. 生物工程學(xué)報, 2000, 16(2):188–192.

[15]Zheng P, Sun ZH. Enzymatic Conversion of Cis-Expoxysuccinate into L(+)-Tartarate by Nocardia sp. SW 13-57. Ind Microbiol, 1994, 4 (3):12–17 (in Chinese).鄭璞, 孫志浩. 用諾卡氏菌酶法轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸生產(chǎn)L(+)-酒石酸的研究. 工業(yè)微生物, 1994,4(3): 12–17.

[16]Lu ZF, Dong W, Xia MZ, et al. Synthesis ofepoxysuccinic acid. special petrochem, 2001,5(3): 7–9 (in Chinese).呂志芳, 董偉, 夏明珠, 等. 環(huán)氧琥珀酸的合成條件研究. 精細(xì)石油化工, 2001, 5(3): 7–9.

[17]Muynck CD, Pereira CSS, Naessens M, et al. The genus Gluconobacter oxydans: comprehensive overview of biochemistry and biotechnological applications. Crit Rev Biotechnol, 2007, 27(3):147–171.

[18]lassen R, Zam H, Korloy W, et al. Preparation of tartaric acid: CN, 951961381. 2000-12-27 (in Chinese).R·克拉森, H·扎姆, W·克勞伊, 等. 酒石酸的備方法: CN, 95196138.1. 2000-12-27.

[19]Elfari M, Ha SW, Bremus C, et al. A Gluconobacter oxydans mutant converting glucose almost quantitatively to 5-keto-D-gluconic acid.Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(6): 668–674.

[20]Marcel Merfort, Herrmann U, Stephanie BM, et al. High-yield 5-keto-D-gluconic acid formation is mediated by soluble and membrane-bound gluconate-5-dehydrogenases of Gluconobacter oxydans. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 73(2):443–451.

[21]Herrmann U, Merfort M, Jeude M, et al.Biotransformation of glucose to 5-keto-D-gluconic acid by recombinant Gluconobacter oxydans DSM 2343. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64: 86–90.

[22]Velizarov S, Beschkov V. Biotransformation of glucose to free gluconic acid by Gluconobacter oxydans: substrate and product inhibition situations. Process Biochem, 1998, 33(5): 527–534.

[23]Qazi GN, Parshad R, Verma V, et al.Diketo-gluconate fermentation by Gluconobacter oxydans. Enzyme Microb Technol, 1991, 13(6):504–507.

[24]Silberbach M, Maier B, Zimmermann M, et al.Glucose oxidation by Gluconobacter oxydans:characterization in shaking-flasks, scale-up and optimization of the pH profile. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(1): 92–98.

[25]Ano Y, Shinagawa E, Adiach O, et al. Selective,high conversion of D-glucose to 5-Keto-D-gluoconate by Gluconobacter suboxydans. Biosci Biotechnol Biochem, 2011, 75(3): 586–589.