唐秀玲　唐秀利

【摘要】目的：建立保暖風的薄層色譜鑒別方法和紫丁香苷HPLC含量測定方法。方法：薄層色譜以保暖風對照藥材和7-羥基香豆素、紫丁香苷對照品作對照；含量測定采用HPLC法測定紫丁香苷含量，色譜柱：SPOLAR C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-水（9∶91）；檢測波長：264nm；流速：1.0ml/min，柱溫：35℃。結(jié)果：薄層色譜斑點圓整、清晰，重復性好。紫丁香苷進樣量在0.04132～2.066μg范圍內(nèi)線性關系良好（r=1.0000），平均回收率為101.2%，RSD=1.3%（n=6）。結(jié)論：所建立的方法簡便快捷，重復性好，結(jié)果準確可靠，能有效控制保暖風的質(zhì)量，可作為保暖風的質(zhì)量標準的主要控制指標。

【關鍵詞】保暖風；7-羥基香豆素，紫丁香苷，薄層色譜法，高效液相色譜法

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2014）17-0015-03

TLC and HPLC for syringoside of Edgeworthia chrysantha Lindl.TANG Xiu-ling1 TANG Xiu-li2

1.Guangxi Institute for Food and Drug Control， Nanning 530021，China；

2.Liuzhou Liutie Central Hospital， Liuzhou 545007，ChinaAbstract：Objective To establish the method of TLC and HPLC for syringoside of Edgeworthia chrysantha Lindl. Methods The matched control medica ，7-hydroxycoumarin and syringoside were used as comparison in TLC； the content of syringoside was determined by HPLC， SPOLAR C18 chromatographic column （5 μ m， 4.6mm × 250mm） was used with acetonitrile-water（9∶91）， the detection wavelength was set at 264 nm ， the flow rate was 1.0 ml/min， and the temperature was 35℃. Results The TLC spots were round and clear with good repeatability. The syringoside sample size showed a good linear relationship at the range of 0.04132～2.066μg （r=1.0000）； the average recovery was 101.2% and the RSD was 1.3% （n=6）.Conclusion The method is convenient， fast and repeatabld， the result is accurate and reliable. Edgeworthia chrysantha Lindl. quality can be effectively controled by it， which can be used as the main index of the quality standard.

Keywords：Edgeworthia chrysantha Lindl.； 7-hydroxycoumarin； syringoside； TLC； HPLC

保暖風為傳統(tǒng)瑤藥“五虎九牛十八鉆七十二風”之風藥，來源為瑞香科植物結(jié)香Edgeworthia chrysantha Lindl. 的全株[1]。分布河南、陜西、長江流域及以南各省區(qū)，廣西各地均有分布[1-3]。保暖風味甘、性溫，歸腎、肝經(jīng)，其根、莖、花可分別人藥，根和莖具有舒筋活絡，消腫止痛功效；花具有養(yǎng)陰安神、明目、祛障翳之功效[4]。為保護、收集、整理和發(fā)展廣西民間瑤藥資源，廣西食品藥品監(jiān)督管理局擬出版《廣西瑤族習用藥材質(zhì)量標準（第一卷）》，對瑤族習用藥材進行質(zhì)量控制指標研究，建立質(zhì)量標準，保暖風是其中品種之一。

保暖風（結(jié)香）化學成分研究報道[4-6]主要含香豆素類、黃酮類、甾類、有機酸化合物等，其中傘型花內(nèi)酯、西瑞香素等成分含量測定方法已有報道[7]。本文采用7-羥基香豆素、紫丁香苷對照品及保暖風對照藥材作薄層色譜鑒別的對照，建立兩個薄層色譜鑒別，結(jié)果斑點圓整、清晰，重復性好；用高效液相色譜法測定紫丁香苷含量，采用甲醇回流提取制備供試品，用乙腈-水（9∶91）為流動相，紫丁香苷與其它雜質(zhì)峰分離良好，按照《中國藥典》2010年版一部附錄[8]“中藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”進行方法學驗證，結(jié)果表明該方法專屬性強，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，可作為保暖風質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀，2487紫外檢測器，Empower色譜工作站；MILLIPORE純水處理器；MIKRO 22R型高速冷凍離心機；梅特勒電子分析天平。

1.2試藥7-羥基香豆素（批號：11739-200501）、紫丁香苷（批號：111574-200201）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純。保暖風分別采集于廣西金秀縣桐木鎮(zhèn)、資源縣兩水鄉(xiāng)、賀州市開山鎮(zhèn)、金秀縣長垌鄉(xiāng)、桂林市、金秀縣六巷鄉(xiāng)，柳州市鹿寨縣、桂林市龍勝縣、桂林市恭城縣等地，經(jīng)鑒定為瑞香科植物結(jié)香Edgeworthia chrysantha Lindl。endprint

2薄層色譜鑒別

2.17-羥基香豆素的鑒別取保暖風粉末1g，加甲醇30ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材1g，同法制定對照藥材溶液，再取7-羥基香豆素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液2～4μl、對品溶液1～2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（6.5∶3.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑點顯色清晰。置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，見圖1。

2.2紫丁香苷的鑒別取本品各2g，加甲醇50ml，超聲30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25ml使溶解，加石油醚（60～90℃）提取兩次，每次25ml，棄去石油醚液，再加三氯甲烷提取兩次，每次25ml，棄去三氯甲烷液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材2g，同法制定對照藥材溶液，再取紫丁香苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液5～10μl、對品溶液2μl ，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的斑點，見圖2。

3紫丁香苷含量測定

3.1色譜條件色譜柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）；檢測波長：264nm；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃，流動相：乙腈-水（9∶91），進樣量10μl。在上述色譜條件下，紫丁香苷峰形良好，與相鄰峰達到基線分離。

3.2溶液的制備

3.2.1對照品溶液的制備取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.2供試品溶液的制備取本品粉末約1g，精密稱定，置燒瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3穩(wěn)定性考察對同一供試品溶液（BNF-5），每隔一定時間測定一次，共測定9次，RSD為0.95%。試驗表明，在24小時內(nèi)被測物穩(wěn)定。

3.4線性范圍考察精密稱取紫丁香苷對照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分別置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10μl，按3.1色譜條件測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結(jié)果表明：紫丁香苷進樣量在0.04132～2.066μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=2.5173×106X -3.0990×103，r=1.0000。

3.5精密度試驗

3.5.1儀器精密度試驗取同一供試品溶液（BNF-5），按“3.1”色譜條件，連續(xù)測定6次，進樣量為10μl。結(jié)果6次測定結(jié)果紫丁香苷峰面積的平均值為902489，RSD為0.49%（n=6）。試驗表明，本法的精密度良好。

3.5.2重復性試驗取同一供試品（BNF-5），按擬訂的方法平行測定6份，結(jié)果紫丁香苷含量的平均值為1.76mg/g，RSD 為1.6%（n=6）。果表明本法的重復性好。

3.6準確度試驗精密稱取已知含量的保暖風0.5g（BNF-5，紫丁香苷含量為1.7622mg/g），共六份，分別精密加入紫丁香苷甲醇溶液（紫丁香苷含量0.7710mg/ml）1ml，揮去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、測定，計算加樣回收率，結(jié)果紫丁香苷的加樣回收率為101.2%，RSD=1.3%（n=6），符合方法學的要求，詳見表1。

3.7耐用性考察用不同品牌色譜柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）、Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）、XBridge C18（5μm，4.6mm×250mm）進行分離、測定，結(jié)果紫丁香苷在上述色譜柱中均得到良好的分離，理論板數(shù)分別為5638、10368、5763。平均含量分別為1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD為0.56%。

3.8樣品測定按“3.2.1”、“3.2.2”制備對照品溶液和10批樣品溶液，照“3.1”項下色譜條件測定，按干燥品計算樣品中的紫丁香苷的含量。10批樣品中含量最高的是BNF-5為0.196%；含量最低的是BNF-6為0.023%。結(jié)果見表2。endprint

2薄層色譜鑒別

2.17-羥基香豆素的鑒別取保暖風粉末1g，加甲醇30ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材1g，同法制定對照藥材溶液，再取7-羥基香豆素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液2～4μl、對品溶液1～2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（6.5∶3.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑點顯色清晰。置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，見圖1。

2.2紫丁香苷的鑒別取本品各2g，加甲醇50ml，超聲30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25ml使溶解，加石油醚（60～90℃）提取兩次，每次25ml，棄去石油醚液，再加三氯甲烷提取兩次，每次25ml，棄去三氯甲烷液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材2g，同法制定對照藥材溶液，再取紫丁香苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液5～10μl、對品溶液2μl ，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的斑點，見圖2。

3紫丁香苷含量測定

3.1色譜條件色譜柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）；檢測波長：264nm；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃，流動相：乙腈-水（9∶91），進樣量10μl。在上述色譜條件下，紫丁香苷峰形良好，與相鄰峰達到基線分離。

3.2溶液的制備

3.2.1對照品溶液的制備取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.2供試品溶液的制備取本品粉末約1g，精密稱定，置燒瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3穩(wěn)定性考察對同一供試品溶液（BNF-5），每隔一定時間測定一次，共測定9次，RSD為0.95%。試驗表明，在24小時內(nèi)被測物穩(wěn)定。

3.4線性范圍考察精密稱取紫丁香苷對照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分別置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10μl，按3.1色譜條件測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結(jié)果表明：紫丁香苷進樣量在0.04132～2.066μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=2.5173×106X -3.0990×103，r=1.0000。

3.5精密度試驗

3.5.1儀器精密度試驗取同一供試品溶液（BNF-5），按“3.1”色譜條件，連續(xù)測定6次，進樣量為10μl。結(jié)果6次測定結(jié)果紫丁香苷峰面積的平均值為902489，RSD為0.49%（n=6）。試驗表明，本法的精密度良好。

3.5.2重復性試驗取同一供試品（BNF-5），按擬訂的方法平行測定6份，結(jié)果紫丁香苷含量的平均值為1.76mg/g，RSD 為1.6%（n=6）。果表明本法的重復性好。

3.6準確度試驗精密稱取已知含量的保暖風0.5g（BNF-5，紫丁香苷含量為1.7622mg/g），共六份，分別精密加入紫丁香苷甲醇溶液（紫丁香苷含量0.7710mg/ml）1ml，揮去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、測定，計算加樣回收率，結(jié)果紫丁香苷的加樣回收率為101.2%，RSD=1.3%（n=6），符合方法學的要求，詳見表1。

3.7耐用性考察用不同品牌色譜柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）、Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）、XBridge C18（5μm，4.6mm×250mm）進行分離、測定，結(jié)果紫丁香苷在上述色譜柱中均得到良好的分離，理論板數(shù)分別為5638、10368、5763。平均含量分別為1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD為0.56%。

3.8樣品測定按“3.2.1”、“3.2.2”制備對照品溶液和10批樣品溶液，照“3.1”項下色譜條件測定，按干燥品計算樣品中的紫丁香苷的含量。10批樣品中含量最高的是BNF-5為0.196%；含量最低的是BNF-6為0.023%。結(jié)果見表2。endprint

2薄層色譜鑒別

2.17-羥基香豆素的鑒別取保暖風粉末1g，加甲醇30ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材1g，同法制定對照藥材溶液，再取7-羥基香豆素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液2～4μl、對品溶液1～2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（6.5∶3.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑點顯色清晰。置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，見圖1。

2.2紫丁香苷的鑒別取本品各2g，加甲醇50ml，超聲30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25ml使溶解，加石油醚（60～90℃）提取兩次，每次25ml，棄去石油醚液，再加三氯甲烷提取兩次，每次25ml，棄去三氯甲烷液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材2g，同法制定對照藥材溶液，再取紫丁香苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液5～10μl、對品溶液2μl ，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的斑點，見圖2。

3紫丁香苷含量測定

3.1色譜條件色譜柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）；檢測波長：264nm；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃，流動相：乙腈-水（9∶91），進樣量10μl。在上述色譜條件下，紫丁香苷峰形良好，與相鄰峰達到基線分離。

3.2溶液的制備

3.2.1對照品溶液的制備取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.2供試品溶液的制備取本品粉末約1g，精密稱定，置燒瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3穩(wěn)定性考察對同一供試品溶液（BNF-5），每隔一定時間測定一次，共測定9次，RSD為0.95%。試驗表明，在24小時內(nèi)被測物穩(wěn)定。

3.4線性范圍考察精密稱取紫丁香苷對照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分別置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10μl，按3.1色譜條件測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結(jié)果表明：紫丁香苷進樣量在0.04132～2.066μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=2.5173×106X -3.0990×103，r=1.0000。

3.5精密度試驗

3.5.1儀器精密度試驗取同一供試品溶液（BNF-5），按“3.1”色譜條件，連續(xù)測定6次，進樣量為10μl。結(jié)果6次測定結(jié)果紫丁香苷峰面積的平均值為902489，RSD為0.49%（n=6）。試驗表明，本法的精密度良好。

3.5.2重復性試驗取同一供試品（BNF-5），按擬訂的方法平行測定6份，結(jié)果紫丁香苷含量的平均值為1.76mg/g，RSD 為1.6%（n=6）。果表明本法的重復性好。

3.6準確度試驗精密稱取已知含量的保暖風0.5g（BNF-5，紫丁香苷含量為1.7622mg/g），共六份，分別精密加入紫丁香苷甲醇溶液（紫丁香苷含量0.7710mg/ml）1ml，揮去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、測定，計算加樣回收率，結(jié)果紫丁香苷的加樣回收率為101.2%，RSD=1.3%（n=6），符合方法學的要求，詳見表1。

3.7耐用性考察用不同品牌色譜柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）、Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）、XBridge C18（5μm，4.6mm×250mm）進行分離、測定，結(jié)果紫丁香苷在上述色譜柱中均得到良好的分離，理論板數(shù)分別為5638、10368、5763。平均含量分別為1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD為0.56%。

3.8樣品測定按“3.2.1”、“3.2.2”制備對照品溶液和10批樣品溶液，照“3.1”項下色譜條件測定，按干燥品計算樣品中的紫丁香苷的含量。10批樣品中含量最高的是BNF-5為0.196%；含量最低的是BNF-6為0.023%。結(jié)果見表2。endprint