賀 俐，吳楊

水稻土壤宏基因組中的β-葡萄糖苷酶基因克隆、表達及酶活的研究

賀 俐，*吳楊

(井岡山大學生命科學學院，江西，吉安 343009)

β-葡萄糖苷酶(Ec3.2.1.21)屬于糖苷水解酶家族3，它能夠水解非還原性末端的β-D葡萄糖苷鍵，釋放出游離的葡萄糖及相應的配基。β-葡萄糖苷酶是纖維素降解中的關鍵酶，對于可再生資源纖維素的利用具有十分重要的意義。本研究從水稻土壤中分離得到β-葡萄糖苷酶基因pds5，將其克隆到表達載體pET32a(+)中，轉化BL21大腸桿菌中，并誘導表達該基因。重組BL21大腸桿菌用IPTG誘導后，所提取的酶蛋白具有β-葡萄糖苷酶的活性，經SDS-PAGE 分析，確定其相對分子質量為83 kD。通過控制pH和溫度的方法，測得該酶酶活最適pH為7.0，最適溫度為37.5℃。

β-葡萄糖苷酶；克??；酶活

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)，又稱乳糖酶，廣泛存在于各種微生物、植物及動物組織中。該酶能夠水解乳糖中的β-1,4-D-半乳糖苷鍵，使其降解成為半乳糖與葡萄糖，同時具有半乳糖苷的轉移作用[1]。β-半乳糖苷酶可用于降解乳糖和生產低聚半乳糖，合成或修飾其它碳水化合物以及促進果蔬軟化和成熟，同時在免疫、檢測及疾病診斷方面也有應用。隨著生物技術的發(fā)展，對編碼此酶的基因結構有了相當了解，人們也獲得了具有優(yōu)良特性酶活性較高的β-半乳糖苷酶，使得β-半乳糖苷酶不僅在食品工業(yè)中的用途越來越廣泛，而且在生物技術領域中也發(fā)揮著重要的作用，并被廣泛應用于醫(yī)藥、化學等領域[2]。目前，工業(yè)用β-半乳糖苷酶主要來源于多種微生物如霉菌、細菌、放線菌及酵母菌[3]。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達了從水稻土壤宏基因組研究中發(fā)現的β-半乳糖苷酶基因pds5，并進行了相關功能的研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

分子生物學工具酶、DNA分子量標準及蛋白分子量標準均購自上海生物工程公司；卡那霉素、氨芐青霉素、IPTG、o-硝苯基-β-D-半乳糖購自廈門泰京生物科技有限公司；其他相關試劑盒購自Novagen公司。

1.2 菌株和質粒

大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)、pUCl8質粒、pET-30a（+）質粒均為本實驗室保藏。

1.3 水稻土壤基因組DNA提取及宏基因組文庫的構建

水稻土壤基因組DNA提取根據參考文獻[4]進行。粗提后的土壤基因組DNA利用低熔點瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化。Sau3AI酶切純化的土壤基因組DNA，蔗糖密度梯度(10%~40%，W/V)離心后收集2 kb以上的DNA片段與BHI酶切回收的pUCl8連接，轉化DH5α。收集白色克隆到96孔板，-80℃凍存。隨機挑選白色克隆進行酶切驗證轉化效率。

1.4 基因克隆

將構建的文庫影印到含0.1%七葉苷和0.25%檸檬酸高鐵銨的LA平板上培養(yǎng)12~15 h后，菌落周圍出現黑色水解圈的即為β-葡萄糖苷酶基因陽性克隆，具體參照文獻[5]進行。

1.5 重組蛋白的誘導表達和純化

重組蛋白的誘導表達參照《分子克隆實驗指南》（第三版）進行。重組蛋白的純化按照Rapid Affinity Purification Kit說明書進行。

1.6 酶活性測定及最適pH值和溫度

酶活性的測定根據參考文獻[6]進行。葡萄糖標準曲線的繪制: 分別吸取10 mg/ mL葡萄糖標準貯備溶液0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1.0 mL于試管中，用蒸餾水加至 1 mL，再加1 mLDNS試劑，充分混合后在沸水中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至 10 mL，在540 nm波長處測定其吸光值。

2 結果

2.1 目的基因的克隆與鑒定

按照材料與方法1.3實驗室已成功構建土壤宏基因組文庫（未發(fā)表）。從篩選平板上挑取較黑的陽性克隆，經PCR擴增后產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測與預期片段大小一致，大小為2800 bp左右。雙酶切得到與PCR產物大小一致的片段，將該目的基因命名為pds5。PCR產物電泳和重組質粒的酶切分析結果見圖１和圖２。

M:marker；1-4:隨機選取的4個樣品進行擴增

M:marker；1-3:不同內切酶組合的酶切效果

2.2 目的蛋白的誘導表達

將誘導菌液與未誘導菌液均10000 g離心2 min。倒掉上清，菌液沉淀先用少量 PBS溶液清洗，誘導菌液沉淀中加10 mLPBS溶液，未誘導菌液中加入300 μLPBS溶液吹起，超聲破碎5~10 min。破碎后誘導液取全液500 μL用于后面的SDS凝膠電泳，將剩余的全液10000 g離心15 min。全液、上清液、未誘導液各取40 μLSDS凝膠電泳。結果如圖3，從圖中可以看出β-葡萄糖苷酶分子量大約為83 kD，與預期結果一致，該酶在加了IPTG才能表達，而且經離心后主要留在上清液中。

M:marker；1:陰性對照；2-3:目的蛋白

2.3 酶反應的最適pH和最適溫度

取稀釋10倍后100 μL酶液，700 μLpH2~8.5 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，200 μL 20 mg/L水楊苷溶液37 ℃水浴10 min中后加2 mL DNS沸水浴10 min，540 nm測吸光度。結果如圖4，可以看出該酶在pH5~8活力較強，最適pH為7.0。取稀釋10倍后0.1 m:酶液，700 μLpH 7.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，200 μL20 mg/L水楊苷溶液25~65 ℃水浴10 min中后加2 mLDNS沸水浴10 min，540 nm測吸光度。結果如圖5，該酶在35~55 ℃活力較強，酶活力最適溫度50 ℃。

圖4 β-葡萄糖苷酶最適pH值

圖5 β-葡萄糖苷酶最適溫度

2.4 β-葡萄糖苷酶活力的測定

將純化前后的酶液用葡萄糖為底物進行酶活測定：取稀釋一定倍數的酶液100 μL，加入200 μL0.5%的水楊苷(溶解于0.1 mol/ L pH值4.8的醋酸緩沖液中) , 55 ℃保溫20 min, 加入 1mLDNS 試劑, 充分混合在沸水中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL，在540 nm波長處測定其吸光值，以加熱滅活的酶液按照同樣方法處理作為空白。以加熱滅活的酶液按照同樣方法處理作為空白。定義每小時由底物產生 1 Lmol 還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為一個酶活單位(U)[7]。標準曲線結果如圖6，根據測定的吸光值，經計算未純化前的酶活力為24.7 U，純化后的酶活力為256.9 U，降低了10.4倍，酶活性較低。

圖6 葡萄糖標準曲線

3 討論

當前在β半乳-糖苷酶基因的克隆和鑒定方面，國內外的主要方法是從纖維素被活躍降解的環(huán)境中分離純化產酶活性微生物, 對所得的菌株鑒定并對其產酶條件及酶學特性等進行研究后，再進一步用分子生物學的方法對其進行克隆、鑒定和表達。而在自然界中超過99% 的未培養(yǎng)微生物組成了地球上生物多樣性的主體[8]，所以長期以來微生物的純培養(yǎng)方法嚴重地限制了我們認識微生物的視野, 使得微生物的多樣性資源難以得到全面的開發(fā)和利用。自從1998 年Handelsman 等人提出宏基因組( Metagenome) 的概念以來，宏基因組技術在開發(fā)未培養(yǎng)微生物以及功能基因、活性物質等方面應用非常廣泛[9]。

本研究利用宏基因組研究方法，避開了傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)，直接從水稻土壤樣品混合微生物中提取基因組DNA，發(fā)現了β-半乳-糖苷酶的功能基因pds5，對其進行了克隆與表達研究，并對重組蛋白的功能進行了初步研究。由于該酶來源于土壤微生物，在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中大多以包涵體形式存在，且酶活較低，因此在后續(xù)研究中可嘗試選擇轉錄型或分泌型pET載體，或者利用信號肽來促進目的基因在大腸桿菌中的表達，或者選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)來有效提高目的蛋白的表達量及酶活，為其工業(yè)化發(fā)酵生產建立很好的基礎[9]。同時，這些研究對探索土壤中的微生物新資源必將起到積極的作用。

[1] Wanarska M, Kur J, Pladzyk R, et a1.Thermostable pyrococcus woesei beta-D-galactosidase-high level expression,purification and biochemical properties[J]. Acta Biochim Pol, 2005, 52: 78l-787.

[2] 聶洪麗，湯麗霞，張詩海，等.富集培養(yǎng)及高質量DNA提取有利于從土壤宏基因組中獲取新鹵醇脫鹵酶基因[J].生物技術通訊,2010,12(6):846-850.

[3] 高秀容，馬力，葉華，等．β-半乳糖苷酶的研究進展[J].生物技術通報,2005(3):18-20.

[4] Zhou J，Brans M A，Tiedje J M．DNA recovery from soils of diverse composition[J]．Appl Environ Microbiol，1996,62:316-322,

[5] 陸堅，杜麗琴，龐浩，等. 高糖土壤微生物宏基因組文庫的構建及β-葡萄糖苷酶基因鑒定[J].基因組學與應用生物學，2013,32(1):30-35.

[6] Heather F, Seidle, Ira Maarten. Physieal and kinetic properties of the family 3 β-Glueosidase from aspergillusniger which is important for cellulose breakdown[J].The Protein Journal, 2004,23(l):11-23.

[7] JenkinsJ, Leggio L L, Harisq, et al. β-glucosidase，pgalactosidase filmy A cellulase polymyxa s filmy F xylanases and two barley glyeanases from a super family of enzymes with a 8-fold α/β-parehiteeture and with two conserved glutamates near the carboxyterminail ends of β-strands four and seven[J].FFBS Lett, 1995，36(2):281-285.

[8] Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Micro biol Rev,1995,59(1): 143-169.

[9] Schmeissor C, Steele H, Streit W R.Metagenomics: biotechnology with non-cuhurable microbes[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2007,75(5) : 955- 962.

CLONE, EXPRESSION AND ACTIVITY OFFROM RICE SOIL METAGENOME

HE Li，*WU Yang

(School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

β-glueosidase (EC3.2.l.21) belongs to glycoside hydrolases superfamily 3, which could hydrolyze β-D-glueosidie bond and release glueose and corresponding aglueone. β-glueosidase is the key enzyme in cellulose degradation. The β-glucosidase gene was cloned into pET32a (+) and then build upon an expression carrier in BL21, and induces the expression of the gene. BL21recombinantinduced by IPTG, the relative molecular mass of the extracted protein with β-glucosidase activity analyzed by SDS-PAGE analysis is 83kD. Through the control of pH and temperature, the optimum pH of the enzyme activity is 7, the optimum temperature is 37.5 ℃.

β-glueosidase; cloning; activity of enzyme

Q785

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.03.010

1674-8085(2014)03-0042-04

2013-12-21；

2014-04-19

國家自然科學基金項目（31060263）；江西省自然科學基金項目（2010GQN0118，20132BAB204011）；江西省教育廳科技計劃項目（GJJ13543，GJJ13544）

賀 俐(1981-)，女，江西吉安人，實驗師，碩士，主要從事水稻抗蟲研究(E-mail:heli@jgsu.edu.cn)

*吳 楊(1980-)，男，江西吉安人，副教授，博士，主要從事逆境分子機制研究(E-mail:wuyangfenghao@sohu.com)