張龍霄，劉珠果，鄭興，戴秋云

1.南華大學(xué) 藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

石頭魚（Synanceia）屬于輻鰭魚綱（Actinoptery?gii）鲉形目（Scorpaeniformes）毒鲉科（Synanceiidae），生活在印度洋和太平洋的熱帶及亞熱帶淺水區(qū)域，是世界上毒性最強的魚之一。其毒性裝置包括13根背鰭棘、2根腹鰭棘、3根臀鰭棘，以及附著在背鰭棘上并分布于背鰭棘兩側(cè)的毒囊。當(dāng)石頭魚受到攻擊時，毒棘會刺入獵物體內(nèi)，毒液從毒囊里擠出，沿著背鰭棘上的溝槽或溝管注入獵物體內(nèi)，引起一系列中毒癥狀，如劇痛、水腫、肌肉麻痹、惡心、嘔吐、腹瀉、出汗、多涎（唾液分泌過多）、心律不齊、低血壓、呼吸窘迫和驚厥等[1-3]。常見的石頭魚有玫瑰毒鲉（S.verrucosa）、粗毒鲉（S.horrida）和S.trachynis（目前尚無中文名稱）等，中國海域的石頭魚為玫瑰毒鲉，主要分布于南海海域。

在石頭魚中發(fā)現(xiàn)的第一種毒素為Stonustoxin（SNTX），來自粗毒鲉，由α、β亞基組成，分別含有703與700個氨基酸殘基，等電點為6.9，晶體結(jié)構(gòu)呈四角形[4]。該毒素具有多種生物活性，包括抑制神經(jīng)肌肉接頭功能、增強血管通透性、強烈的溶血作用、促進(jìn)血小板凝集、引發(fā)水腫等，對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為 17 ng/g（靜脈注射）[5]。在S.trachynis中發(fā)現(xiàn)的Trachynilysin（TYL，目前還未測出全部序列），具有溶血活性、致死性及增加血管通透性的作用[6]。在玫瑰毒鲉中發(fā)現(xiàn)了Verrucotoxin（VTX）和Neover?rucotoxin（NeoVTX）。VTX為高分子量糖蛋白，由2個α（相對分子質(zhì)量83×103）和2個β（相對分子質(zhì)量78×103）亞基組成。β亞基與SNTX的β亞基具有相同的N端，且具有96%的序列同源性。VTX對小鼠的LD50為40 ng/g（靜脈注射），還能裂解兔紅細(xì)胞和降低大鼠動脈血壓[7-8]。NeoVTX由α、β亞基組成，分別含有703與700個氨基酸殘基，與SNTX的α、β亞基分別具有高達(dá)87%和95%的同源性。NeoVTX的β亞基與VTX的β亞基的同源性為90%。NeoVTX也具有溶血活性和致死性，對小鼠的LD50為47 ng/g（靜脈注射）[9]。國內(nèi)對石頭魚的研究極少，僅停留于病例報告。有關(guān)石頭魚毒素的表達(dá)目前僅有1篇報道。Farid等擴增出SNTX的α、β亞基的cDNA并連接到載體，分別導(dǎo)入大腸桿菌PR700進(jìn)行表達(dá)，重組α、β亞基均能與天然SNTX的抗體結(jié)合[10]。

為研究石頭魚粗毒液毒性成分并闡明其基因序列，我們分離鑒定了中國南海石頭魚粗毒液蛋白質(zhì)，釣取玫瑰毒鲉毒素NeoVTX的α和β亞基的cDNA序列，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)α亞基的大腸桿菌菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

玫瑰毒鲉來自中國南海海域；大腸桿菌DH5α購自天根生化公司；大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；pET-22b（+）載體購自Novagen公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司。其他主要試劑及來源：蛋白酶抑制劑Complete Ultra Tablet（羅氏診斷公司）；TRIzol（Invitrogen公司）；3'RACE及5'RACE試劑盒（TaKaRa公司）；Cre重組酶（近岸蛋白質(zhì)公司）；氨芐西林（Amresco公司）；氯霉素（Merck公司）；酵母提取物、蛋白胨（Oxoid公司）；DNA凝膠回收試劑盒、2×Ex Taq Master Mix和廣譜彩虹預(yù)染Marker（康為世紀(jì)公司）；DNA Marker（天根生化公司）；His標(biāo)簽蛋白純化樹脂（Ni-NTA Res?in）（?；锕荆?；BCA Protein Assay Kit（Thermo公司）。引物合成與基因測序由奧科鼎盛公司完成。

1.2 石頭魚粗毒液的提取

沿著石頭魚背鰭棘剪開皮膚和肌肉，將背鰭棘從脊柱上剪斷，小心剝離毒棘末端的肌肉，使毒囊暴露，用注射器抽取毒囊中的粗毒液，加入Complete Ultra Tablet，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 石頭魚粗毒液的分離及鑒定

將粗毒液梯度稀釋至1/8、1/16、1/32、1/64、1/128并進(jìn)行SDS-PAGE，將主要條帶切割，行液相色譜-質(zhì)譜分析（LC-MS）。為明確粗毒液中的天然蛋白質(zhì)，將粗毒液稀釋至1/64，并進(jìn)行天然凝膠電泳。

將粗毒液溶解于0.01 mol/L的PBS（pH7.0），4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行分離［TSK Gel G2000 SWxl凝膠柱，流動相為0.5 mol/L NaCl-0.01mol/L PBS（pH7.0），流速0.5 mL/min］，收集組分并做SDS-PAGE。

1.4 毒腺組織RNA的提取

刮下毒棘上的毒腺組織，液氮冷凍后搗碎，用TRIzol試劑提取石頭魚毒腺組織RNA。

1.5 NeoVTX α和β亞基cDNA的克隆

根據(jù)文獻(xiàn)[9]設(shè)計引物，按照試劑盒說明書，以毒腺RNA為模板進(jìn)行3'RACE（α亞基擴增條件：94℃5 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2.5 min循環(huán)35次，72℃ 5 min；β亞基擴增條件延伸時間為3.5 min，其余條件同α亞基）和5'RACE（α亞基擴增條件：94℃ 5 min，以 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1.5 min循環(huán)35次，72℃ 5 min；β亞基擴增條件延伸時間為25 s，其余條件同α亞基）。反應(yīng)結(jié)束后將目的片端連接pMD18-T載體，挑選PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，分別獲得石頭魚α和β亞基的3'及5'端序列。根據(jù)得到的序列，分別設(shè)計擴增α和β亞基全長cDNA的引物CA-F1（5'GGACGACTCACACAAC TCAG3'）、CA-R1（5'GGAGTCTTGGCATCAGTAAC 3'）、CB-F1（5'AGACTCCTACACAACTCAGC3'）和CB-R1（5'TAAGATACGTCCATGTACTGC3'）。 CAF1和CA-R1用于擴增α亞基，CB-F1和CB-R1用于擴增β亞基（擴增條件均為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2.5 min，循環(huán)35次；72℃ 5 min）。得到完整的α和β亞基cDNA后連接pMD18-T載體進(jìn)行測序，最終獲得α和β亞基cDNA序列。

1.6 α和β亞基cDNA序列的優(yōu)化

α亞基13、332、534、557位，β亞基13、24、284位均存在CGA密碼子，而大腸桿菌對CGA的識別率很低，故須對α、β亞基cDNA序列進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)CGA的位置，采用重新合成基因及PCR修正等方法，拼接得到了適于大腸桿菌表達(dá)的α和β亞基cDNA序列。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b（+）-NeoVTXα及pET-22b（+）-NeoVTXβ的構(gòu)建

為了將α和β的cDNA連入pET-22b表達(dá)載體，設(shè)計重組引物α-F（5'AAGAAGGAGATATACATAT GTCTTCAGATATCATGGTA3'）、α-R（5'GGTGGTG GTGGTGCTCGAGAAGTAATCTGACAGTTCC3'），以優(yōu)化的α和β亞基cDNA為模板進(jìn)行擴增（擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2.5 min，循環(huán)35次；72℃ 5 min），得到用于重組的α和β亞基，按照Cre重組酶說明書，將用于重組的α和β亞基連入pET-22b表達(dá)載體，測序表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

1.8 α、β亞基表達(dá)菌株的構(gòu)建

將鑒定無誤的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b（+）-NeoVTXα、pET-22b（+）-NeoVTXβ轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Rosetta，用含Amp和Cam的LB平板篩選，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落增菌后進(jìn)行測序。

1.9 工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測

將工程菌接種于含Amp和Cam的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm約為0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG（同時設(shè)置不加誘導(dǎo)劑及使用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的對照組），30℃連續(xù)培養(yǎng)5 h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE。將剩余的重組菌冰浴超聲波裂解（400 W，超聲 3 s，間隔 5 s，總時間為 10 min），5000 r/min離心20 min，收集上清液和沉淀（包涵體）進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)方式。

1.10 α亞基的大量表達(dá)和親和層析純化

將測序正確的表達(dá)pET-22b（+）-NeoVTXα的單菌落接種于10 mL培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后，按菌液∶培養(yǎng)基為1∶100的比例接種到1 L培養(yǎng)基中，按照上述方法收集菌體，超聲波裂解（400 W，超聲3 s，間隔5 s，總時間為40 min），5000 r/min離心20 min，收集沉淀，用UNTA-0溶液溶解，0.45 μm濾膜過濾除去雜質(zhì)，用帶有組氨酸標(biāo)簽的鎳-瓊脂糖柱親和層析純化。NeoVTX α蛋白平衡液中的咪唑濃度為20 mmol/L，洗脫液中的咪唑濃度為500 mmol/L。SDSPAGE檢測蛋白質(zhì)純度，并用BCA Protein Assay Kit測定蛋白質(zhì)濃度。

2 結(jié)果

2.1 粗毒液的分離鑒定

粗毒液的SDS-PAGE、天然凝膠電泳及凝膠過濾HPLC見圖1～3。粗毒液稀釋至1/16后上樣，得到6條蛋白質(zhì)條帶（標(biāo)記為A、B、C、D、E、F），經(jīng)質(zhì)譜鑒定，確定 A 為 NeoVTX β，B 為 NeoVTX α（分別有99、69個肽段與β、α亞基序列匹配，基本覆蓋了整個亞基序列），C、D、E、F為4個未知的蛋白質(zhì)，其中，D、F與NeoVTX β有最高的匹配度（分別有41、19個肽段屬于β），C與β微管蛋白、E與3-磷酸甘油醛脫氫酶的匹配度最高（分別有38、11個肽段屬于β微管蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶）。粗毒液天然凝膠圖（圖2）中，G為完整的NeoVTX，H為NeoVTX解離的亞基。凝膠過濾HPLC（圖3）與電泳圖類似，NeoVTX在上清液中含量最高，其他組分豐度較低。

2.2 α、β亞基cDNA序列的克隆

經(jīng)過3'RACE、5'RACE和全cDNA序列的擴增，得到了α和β亞基cDNA全序列。將cDNA序列連入pMD18-T載體，測序并翻譯，得到如下蛋白質(zhì)序列。

α亞基序列:

MSSDIMVMPALGRPFTLGMLYDTRREKLIPGFSLFGDETLQQYQ SSNTQRSSEFKIVASDSTEPKSSAMDIEASLGVSFLGGLVEVGG SAKYLNNTKKYQNQSRVTLKYKATTIYKQFTAPPGTVKVQETVI TQRGLATHVVTGILYGANAFFVFDSDKVEDTNLQDIQGKMEAVI KKIPTTSIEGSASVQLTDEEKSLASNLSCKFHGDFLLESLPTTF EDAVTTYQTLPTLLGEDGASAVPMKVWLVPLKKFFSKAKLLTQE ITVSKVRRIHTTLEELYKLKRRANEAMDDKLVQQIPLIHDKISN FHQIFQDYMLTVQKKIAEKLPLVRAGTESEQSLQKIIDDRAKSP FSNENVSTRLEVIEREIAVLKSCAGMVEGTQAKFVSNQTELDRE VLAEDVKHALCFVFTSVERNDPYLKVLSDYLEPPDSKDGKEAVP STEDKWCFSTRVVLKMKQRAQTFCDHVNDFEKSRNVGFFVTALE NGKFQGASIYHYKEGSLATQDFTFPRMPFVQGYKKRSDLLWYAC DLTFDRNTINIWVSLSDNDTFAASEHGKRQNYPKHPERFLCYNQ VLCNEGLTGKHYWEVEWNGYVDVGVAYISISRKEDNWVSAIGHN TCSWVFSSIPRAGYVERYNQRQYYVTVPTPGFKQLGVFLNWPDG SLSFYAVSSDEVHHLHTFKTKFTEPVYPAFCLGYRFDHGTVRLL

β亞基序列：

圖1 粗毒液的SDS-PAGE

圖2 粗毒液的天然凝膠電泳

圖3 粗毒液的凝膠過濾分離

MPSDILVVAALGRPFTLGMLYDARNDKLIPGFTLWEDEVIEEST VENSQPSSAFEIIASDSIDDKSSLMDIEASLKASFLGGLVEVGG SAKYLNNQKKFKNQSRVTLQYKATTNFKQLMTNLGTKHVEYTEL FENIQATHVVIGILYGANAFFVFDSNKVDSTNVQEIQGQMEAVI KKIPSVEISGKASVQLTSEETDITNSFSCEFHGDFFLTSNPTTF EDAVKTYQQLPQMMGKDNAVPMTVWLVPMVNFYSEAPQLMADSS TPILRKVRNTLEAIVQVQMRCNDALDDPTVNLFTEVQRKLSDFQ IICDDHMSKLQATIAKKLFAIRSGDEDESALVNLFEENLQSPFN IESLNMWMEFEEREINVLKSCMDILTKAKPKVIFNQGVFFKELY DSKVKHGLCYVFTNVTKNDDFLTVLNDFLDSPQSRPKKLRPSPK DYWYSYDDIPEMMREKAHLFRNLAKEMNNRCVHFFVTAINNPKQ EGAGIHYYRESIQIIHEFTKPHMPDVETIKDRRELQWYDCELTL DTETAHQVLTLSEGNKKAVSGSTKSPADHFEKFSHFQQVMCTKG LSGRHYWELEWSGHVSAGVTYKGISRKTSTPDSSLGKNQKSWVF EYTKKSGYQQIHNGKNARVTVSSIGFKQLGVYLDWPAGTLSFYM VNKAWVTHLHTFHTKFYEAVYPAFLIGDAQQKVNGQIKLL

將2個亞基的序列與文獻(xiàn)[9]中α、β的序列進(jìn)行BLAST比對，同源性均高達(dá)99%。

2.3 工程菌測序

對α、β亞基cDNA序列進(jìn)行優(yōu)化后設(shè)計重組引物，擴增得到可以使用Cre重組酶進(jìn)行重組連接的cDNA序列，分別連入pET-22b（+）載體，測序，得到重組表達(dá)載體 pET-22b（+）-NeoVTXα、pET-22b（+）-NeoVTXβ，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta后，挑取菌落進(jìn)行測序，結(jié)果均正確，表明得到含有目的基因的工程菌。

2.4 工程菌表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定

將pET-22b（+）-NeoVTXα工程菌用IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體并裂解，收集上清液與沉淀進(jìn)行SDSPAGE（對照組也依此進(jìn)行）。工程菌誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前有明顯增加的蛋白條帶，相對分子質(zhì)量約75×103，為構(gòu)建的工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后的外源蛋白。重組α亞基幾乎都分布于超聲波裂解后的菌體沉淀中，以包涵體的形式存在，上清液中含量很少（圖4）。β亞基較誘導(dǎo)前無明顯增加。

2.5 α亞基的表達(dá)及純化

經(jīng)1 L發(fā)酵體系培養(yǎng)，收集菌體，超聲波裂解、離心并溶解沉淀，Ni-NTA純化帶6×His標(biāo)簽的α亞基，得到純度大于95%的重組蛋白0.45 mg（圖5）。

3 討論

我們除了對石頭魚粗毒液中豐度高的NeoVTX進(jìn)行研究外，對豐度較低的蛋白質(zhì)也進(jìn)行了探討。經(jīng)過質(zhì)譜測序，推測上述D、F為分子較小的毒素或NeoVTX β的降解片段，C、E為β微管蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶。值得注意的是，有些分子較小的蛋白質(zhì)或多肽也具有毒性，如在奧氏江魟（Potamotrygon orbignyi）中發(fā)現(xiàn)的 Orpotrin 和 Por?flan。Orpotrin僅有9個氨基酸殘基，仍然具有強烈的收縮血管的作用；Porflan含有18個氨基酸殘基，可與細(xì)胞膜磷脂相互作用，與江魟毒素的誘導(dǎo)過敏反應(yīng)有緊密關(guān)系[11-12]。D和F是否在石頭魚毒性中扮演重要的角色有待進(jìn)一步研究。

圖4 α亞基的表達(dá)鑒定

圖5 純化的α亞基的凝膠電泳

本研究中的南海石頭魚NeoVTX的α、β亞基與在日本沖繩海域捕撈的石頭魚NeoVTX的α、β亞基的同源性均為99%，說明兩者的親緣性很高。

經(jīng)密碼子優(yōu)化后，α亞基在pET-22b（+）載體中可有效表達(dá)，β亞基經(jīng)密碼子優(yōu)化后表達(dá)仍較困難，后改用pET-24a（+）和pET-28a（+）載體表達(dá)，表達(dá)量仍較低，目前正在嘗試其他表達(dá)體系。

總之，我們獲得了中國南海石頭魚粗毒液中的毒性蛋白質(zhì)NeoVTX，克隆了其cDNA序列，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)NeoVTX α亞基的大腸桿菌菌株，為制備中國石頭魚抗毒素奠定了基礎(chǔ)。

[1]Warrell D A.Venomous bites,stings,and poisoning[J].Infect Dis Clin N Am,2012,26:207-223.

[2]Khoo H E.Bioactive proteins from stonefish venom[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2002,29:802-806.

[3]Kiriake A,Suzuki Y,Nagashima Y,et al.Proteinaceous tox?ins from three species of scorpaeniform fish(lionfish Pterois lu?nulata,devil stinger Inimicus japonicus and waspfish Hypo?dytes rubripinnis):close similarity in properties and primary structures to stonefish toxins[J].Toxicon,2013,70:184-193.

[4]Yew W S,Kolatkar P R,Kuhn P,et al.Crystallization and preliminary crystallographic study of stonustoxin,a protein le?thal factor isolated from the stonefish(Synanceja horrida)venom[J].J Struct Biol,1999,128:216-218.

[5]Low K S,Gwee M C,Yuen R,et al.Stonustoxin:a highly po?tent endothelium-dependent vasorelaxant in the rat[J].Toxi?con,1993,31:1471-1478.

[6]Kreger A S.Detection of a cytolytic toxin in the venom of the stonefish(Synanceia trachynis)[J].Toxicon,1991,29:733-743.

[7]Yazawa K,Wang J W,Hao L Y,et al.Verrucotoxin,a stone?fish venom,modulates calcium channel activity in guinea-pig ventricular myocytes[J].Br J Pharmacol,2007,151:1198-1203.

[8]Garnier P,Goudey-Perriere F,Breton P,et al.Enzymatic properties of the stonefish(Synanceia verrucosa Bloch and Sch?neider,1801)venom and purification of a lethal,hypotensive and cytolytic factor[J].Toxicon,1995,33(2):143-155.

[9]Ueda A,Suzuki M,Honma T,et al.Purification,properties and cDNA cloning of neoverrucotoxin(neoVTX),a hemolytic le?thal factor from the stonefish Synanceia verrucosa venom[J].Biochim Biophys Acta,2006,1760:1713-1722.

[10]Ghadessy F J,Chen D,Kini R M,et al.Stonustoxin is a nov?el lethal factor from stonefish(Synanceja horrida)venom,cD?NA cloning and characterization[J].J Biol Chem,1996,271(41):25575-25581.

[11]Concei??o K,Konno K,Melo R L,et al.Orpotrin:a novel va?soconstrictor peptide from the venom of the Brazilian stingray Potamotrygon gr.orbignyi[J].Peptides,2006,27:3039-3046.

[12]Concei??o K,Santos J M,Bruni F M,et al.Characterization ofa new bioactive peptide from Potamotrygon gr.orbignyi freshwater stingray venom[J].Peptides,2009,30:2191-2199.